PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
• Setiap mahasiswa harus memakai baju praktikum
selama praktikum berlangsung
• praktikan tidak diperkenankan merokok, makan,
minum ataupun mamasukkan jari ataupun benda-
benda lain ke dalam mulut
• bila terjadi kecelakaan bagaimanapun kecilnya,
misalnya mendapat luka atau biakan bakteri
tumpah, segara laporkan ke instruktur
• bila tetesan kuman jatuh ke meja ataupun kulit
segera bersihkan dengan desinfektan
• alat yang sudah digunakan dimasukkan ke dalam
larutan lisol yang tersedia ose yang telah dipakai
dibakar/ diflamber dahulu sebelum disimpan.
Biakan kuman harus ditutup bila tidak dipakai.
Sampah dibuang ke tempat sampah
 Materi Praktikum
• Pembuatan Media
• Pewarnaan Gram
• Morfologi, pertumbuhan dan pembiakan bakteri
• Flora normal udara, kulit dan mulut
• Kepekaan Bakteri terhadap desinfektan dan antiseptik
• Uji Kepekaan Antibiotik
• Pemeriksaan mikroba Makanan, Minuman dan Jamu
– ALTB
– MPN Coliform
 Pembuatan Media
• Nutrient Agar  agar miring & plat
• Pepton Dilution Fluid
• Plate Count Agar
• Brilliant Green Lactose Broth
• Muller Hinton Agar
• Nutrient broth
 Sterilization

• Seluruh peralatan, media yang digunakan

dalam laboratorium mikrobiologi harus
steril
• STERIL—bebas dari mikroorganisme
hidup, untuk mencegah mikroorganisme
yang tidak diinginkan mengkontaminasi
kultur
 Sterilization
• Sterilisasi udara panas = Hot Air Sterilization
– 170 C for 1 hour
• Equipment Temperature
• Put in oven for 2 hours
• Wrap in paper, foil, etc.
• Sterilisasi uap = Steam Sterilization
– 121 C for 15 min. MUST have 15 psi pressure
• Liquid Media or Equipment
 Media
• Media kultur
mengandung nutrisi
yang diperlukan untuk
menumbuhkan
mikroorganisme dalam
Lab.
• Empat jenis media
yang sering digunakan
• Broth  media cair yang mengandung nutrisi untuk
pertumbuhan bakteri. Diletakkan dalam tabung gelas
bertutup plastik ataupun logam.

• Agar  media padat ataupun semi padat, cair pada

suhu 100o C dan memadat pada suhu 40o C.

• Agar plates—plat Agar  Petri dish yang terisi agar

untuk pertumbuhan bakteri. Mempunyai permukaan
yang luas dan digunakan untuk isolasi mikroorganisme.
Sesudah bakteri diinokulasi , inkubasi dilakukan secara
terbalik untuk mencegah kondensasi dari tutup petri dish
ke agar.

• Agar miring digunakan untuk peremajaan kultur

• Agar tegak digunakan untuk mengetahui adanya

pembentukan gas ataupun kebutuhan gas dari
pertumbuhan mikroba.
 Pembiakan Bakteri
subkultur
• Biakan kuman
• Media
• Ose/sengkelit/neddle
• inkubator
 Biakan bakteri
• Bacillus subtilis
• Bacillus violence
• Escherichia coli
• Staphylococcus aureus
• Serratia marcecens
 Transfer Instruments
• Subculturing istilah yang digunakan untuk
memindahkan mikroorganisme dari satu medium
ke medium yang lain. Misal bakteri yang tumbuh
pada media cair akan dipindahkan ke media
padat.

• Wire loops—sengkelit—ose digunakan untuk

memindahkan mikroorganisme dari liquid media
to liquid or solid media.

• Needles digunakan untuk memindahkan

mikrooganisme ke dalam agar tegak
Teknik subkultur
• Bacti-cinerator
• Dish family
 • Spread holder

• Disposable- cell spreader

GRAM STAINING
 PEWARNAAN
Bacteria mempunyai indeks bias yang sama
dengan air,  jika bakteri diamati dibawah
mikroskop cahaya tampak bening hampir
tak terlihat oleh mata telanjang.
Beberapa metode pewarnaan digunakan
untuk membuat sel dan struktur sel lainnya
dapat terlihat dengan mikroskop cahaya
Simple stains  menggunakan satu
pewarna untuk mewarnai dinding sel.
Steps:
1. Letakkan kaca objek pada staining
rack.

2. Testeskan warna dasar : crystal

violet (1 min.),
Safranin (2 min.), or Methylene blue
(2 min.).

3. Cuci kaca objek dengan air

4. Keringkan dengan kertas penyerap.

 Differential Staining
Pewarnaan Differential menggunakan dua
atau lebih warna
Pewarnaan sederhana & differensial
digunakan untuk mengamati morfologi sel,
tetapi pewarnaan differensial memberikan
informasi yang lebih banyak mengenai
karakteristik dinding sel
The most common differential stain used in
microbiology is the Gram Stain.
 Pewarnaan Gram

 The Gram Stain is a differential stain.

 Menggunakan Empat reagen
 Membedakan bakteri berdasarkan dinding sel
bakteri
 Gram Positive bacteria mempunyai dinding sel
tebal yang mengandung Peptidoglycan.
 Gram Negative bacteria mempunyai dinding sel
yang lebih tipis, mengandung Peptidoglycan
dan Lipopolysaccharides (LPS).
 Notice that both Gram Positive and Gram
Negative bacteria have a cell wall composed
primarily of Peptidoglycan.
 Pewarnaan Gram
Gram Staining Steps
1. Crystal violet sebagai pewarna pertama—
primary stain.
2. Gram’s iodine – larutan lugol berfungsi
sebagai mordant (membantu ikatan warna
pertama dengan dinding sel
3. Decolorizer digunakan untuk menghilangkan
warna pertama (crystal violet). Decolorizer
dapat berupa pelarut organik (acetone or
ethanol or a combination of both.)
4. Safranin, sebagai pewarna akhir –counter stain
digunakan untuk mewarnai sel yang telah
kehilangan pewarna pertama akibat dari
dekolorisasi alkohol
Gram Staining Procedure
 The Gram staining method

• 1. A small sample of a
bacterial culture is
removed from a culture.
In this example it is being
taken from a broth culture
of the pure microbe but it
could be removed from a
culture on solid medium .
 The Gram staining method

2. The bacterial suspension

is smeared onto a clean
glass slide. If the bacteria
have been removed from
a culture on solid media it
will have to be mixed with
a drop of distilled water.
 The Gram staining method

3. The bacterial smear is

then dried slowly at first
and then, when dry,
heated for a few seconds
to the point when the
glass slide is too hot to
handle. This fixes ie kills
the bacteria making the
slide safe to handle. Care
must be taken not to
overheat.
 The Gram staining method

4. Once cool, the slide is

transferred to a support
over a sink and flooded
with a stain called
Gentian Violet. The stain
is left on the slide for
about 1 minute. This
stains all the bacteria on
the slide a dark purple
colour.
 The Gram staining method

5. The Gentian Violet is

gently washed off the
slide with running
water
 The Gram staining method

6. The bacterial smear is

then treated with Gram's
iodine. This iodine
solution reacts with the
Gentian Violet turning it a
very dark shade of blue.
 The Gram staining method

7. After about 30 seconds

the slide is gently rinsed
with ethyl alcohol (just let
it flow over the slide)
which causes the dye-
iodine complex to be
washed out of some
bacteria but not others.
This is called
decolourisation.
 The Gram staining method

8. We now treat the slide a

compound which stains the
Gram-negative cells a colour
which contrasts markedly with
the blue-black colour of the
Gram-positive cells. The stain
common used for this is
fuchsin which is red. This is
called the counterstain.
Bacteria in the smear which
are Gram-positive are
unaffected by the counterstain.
 The Gram staining method

9. The counter stain is

left on the smear for
about 30-60 seconds
and then gently rinsed
away with running
water.
 The Gram staining method

10. After the counterstain

has been rinsed off, the
slide is placed between
some absorbent paper
and the excess water
gently blotted off. Care
must be taken not to rub
the slide with the blotting
paper because this would
remove the adhering
bacteria.
 Hasil Pewarnaan Gram
 Ungu atau biru gelap  bakteri Gram
positif bentuk ( kokus, batang)
 Merah  bakteri Gram negatif (kokus,
Batang)

1. Gram Positive Cocci (GPC)

2. Gram Positive Bacilli (GPB)
3. Gram Negative Cocci (GNC)
4. Gram Negative Bacilli (GNB)
Bacterial Cell Shapes
 Aerobic Plate Count,
angka lempeng total bakteri
Plate Counts
• Mengukur jumlah sel yang viable pada
sampel
• Sel yang diisolasi pada media agar nutrien
akan menghasilkan satu koloni
• Koloni tsb mendeterminasikan jumlah sel
yang ada di sampel
Pour Plate
• Pada metode ini, 0,1 sampai 1,0 ml dilusi
dipindahkan ke petridish steril dan
ditambahkan dengan agar nutrien yang
telah didinginkan pada suhu 50°C.
• Ketika agar mengeras sel, dan setelah
inkubasi, koloni dihitung
Spread plate
• 0,1 -0,2 ml sampel di pindahkan ke
petridish yang telah mengandung media
solidified nutrient agar
• Larutan diratakan di dalam petri dengan
menggunakan bent glass rod steril.
Pour plate dan Spread plate umumnya
digunakan untuk sampel yang berisi 100
organisme/ml.
 Angka Lempeng Total bakteri
• Untuk mengetahui jumlah bakteri total
aerob yang hidup
• kecuali
– Obligate Anaerobes
– Microaerophiles
 Plate Counts
• Asumsi
– koloni dapat muncul dari satu sel bakteri

• Dilaporkan sebagai
– Colony Forming Unit (CFU)/gram or ml
– NOT at total bacteria
– Koloni/gram atau koloni/ml
 Kegunaan ALTB
• Mengevaluasi sanitasi suatu produk
• Memprediksi masa kadaluarsa
• “Safety” Indicator
• Monitor Environment
 Keterbatasan ALTB
• Hanya bakteri aerob yang dapat dihitung
• Tipe bakteri tidak diketahui
• Media yang digunakan tidak dapat mensupport
pertumbuhan bakteri tertentu
• Eye strain/Human Error
• Kadang sulit membedakan antara partikel
makanan dan koloni bakteri
• Tidak dapat digunakan untuk makanan
fermentasi
• Kadang koloni terlalu kecil untuk dilihat
 Protocol for Plate Counts
• Homogenisasi sampel
– 1:10 dilution
– 1 part sample to 10 parts total volume
• Blend in Blender or Stomacher for 2 min.

90 ml of diluent
10 g/ml sample

1:10 Dilution – 10-1

 Formula
• 10 ml/g sample, want 1:100 dilution
– 100 – 10 = 90 ml of diluent needed
• Start with Different Sample Sizes
– 50 g sample
• Must have 500 g total volume for 1:10
• 500 – 50 = 450 ml diluent needed
– 95 ml sample
• Must have 950 total volume for 1:10
• 950 – 95 = 855 ml of diluent
 Plate Count Protocol
Pengenceran berseri
• Dilakukan pengenceran hingga diperoleh
koloni dalam plat yang dapat dihitung
– gunakan NEW STERILE PIPET diantara setiap
pengenceran
– Place pipet tip down in pipet tanks
• Shake each dilution bottle 25 times in a 90
degree arc within 7 seconds.
• Sebagai pengencer dapat digunakan 
Phosphate Buffer or Peptone Buffer
 Dilutions

Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

(1:10) (1:100) (1:1000) (1:100000)
(1:10000)
 Plating
Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish

10-2 10-3 10-4 10-5

10 -1

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
 APC – Protocol
• Tambahkan agar sekitar 18-20 ml dengan
temperatur (45-50o ), molten plate count agar to
the petri dish.
– Agar MUST be tempered or the bacteria will be killed
by heat
• Swirl 10 times in each direction
• Allow to Solidify
• Inkubasi terbalik pada 35-37 C selama 48 hours
 Counting Plates
• Hanya plat yang mempunyai 25-250 koloni
• More than 250
– Too Numerous To Count – TNTC
• Less than 25
– Too Few to Count - TFTC
 Counting Plates
Plate 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000

1 TNTC1 TNTC TNTC 200 222

2 TNTC TNTC TNTC 150 10
Average - - - 175 -
1
Too Numerous to Count
2
Too Few to Count
•Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor
•Count is 175 x 104
•Must Convert to TWO Significant Digits
•1.8 x 106 cfu/ml or g
 Counting - Examples
Plate 10-1 10-2 10-3 10-4
1 TNTC 300 150 10
2 TNTC 200 100 20
Average - 250 125 TFTC

Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE

PLATE is in RANGE, use BOTH for Average.
250 x 102 – 2.5 x 104
125 x 103 – 1.3 x 105
AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml
 Counting Examples
Plate 10-1 10-2 10-3 10-4
1 TNTC TNTC TNTC 300
2 TNTC TNTC TNTC 400
Average - - - 350
All Dilutions are outside Range so we MUST use counts
Outside range
350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g*
Use an “*” when using dilutions outside countable ranges
This means it is an ESTIMATED count
 Counting Examples
Plate 10-1 10-2 10-3
1 TNTC 300 10
2 TNTC 400 5
Average -

If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution

(LOWER COUNTS)
7.5 x 103 cfu/ml or g*
 Overloaded Plates
• Use Highest Dilution and Use Grid on Colony
Counter
– 1 Grid = 1 cm2
– A standard Plastic Plate has 56 cm2 surface area
• If <10 colonies/cm2, count 12 squares (6
consecutive horizontally and 6 consecutive
vertically)
– Total and Divide by 12 (average). Multiply by 56 to
get total colonies on plate. Report as Estimate
• If >10 colonies/cm2
– Count 4 squares, average and multiply by 56
Obtaining Isolated Colonies
•Goal is to get Isolated Colonies from Food and/or Cultures
•Colonies can be Identified and Further Evaluated

•Collect loopful of culture

2 •Streak in each area starting
1 3 with area 1
4 •Flame Loop in between
areas
MPN Coliform
• Merupakan uji statistik jumlah sel yang didasarkan
pada teori probabilitas.
• Tujuannya untuk mendilusi sampel dan
mendeterminasi hasil dilusi tersebut
• Menggunakan 3 set tabung yang setiap setnya berisi
3-5 tabung
• 3 set tabung tersebut diencerkan. Setelah inkubasi
ada atau tidaknya mikroba dicatat
• Produksi gas juga dicatat, kmd dibandingkan dengan
tabel MPN
• MPN biasanya digunakan untuk menghitung
Coliform pd sampel air
Untuk mengetahui Total Coliform dan Fecal Coliform
dalam 100 ml air digunakan metode MPN

1. Presumptive Test
Pembiakan pada kaldu laktosa

2. Confirmed test
Pembiakan pada BGLB,
berdasarkan hasil positif dari Presumptive Test

Penentuan MPN
Completed Test

- Pemeriksaan lanjutan dari Confirmed Test

- Untuk menentukan E. coli

A. Presumptive test
Sampel
air

a 1 mL a 0,1 mL
a 10 mL

Inkubasi 35 ± 0,5 oC , 24 jam

- + + + + + - + - + - - + -
-
Lihat tabung yang membentuk gas Lanjut ke Confirmed Test
B. Confirmed test
Lakukan secara duplo

BGLB

Inkubasi pada 35 ± 0,5 ºC dan 44,5 ± 0,2 ºC, 24 jam

Periksa tabung dengan gas,

2 1 0  tabel MPN = 6,8

Lakukan completed test

EMB/Endo (35 ºC, 24 jam)

Isolasi dan identifikasi koloni tersangka

C. Completed Test

Nomor tabung positif

2 3 4 5 6 8 10 11

Hasil IMViC :

+ + - - : E. coli
- - ++ : Enterobacter

EMB/Endo (35 ºC, 24 jam)

Koloni tersangka (merah, kilat logam)

Isolasi & identifikasi

 I (indol); M (merah metil); V (Voges Proskauer); C (Simmon citrate)
Presumptive test
Confirmed test
Completed test
Presumptive test
Confirmed test
 SK MenKes RI (2002)

Peryaratan air minum

1. MPN Total Coliform 0

2. MPN Fecal Coliform 0
3. Tidak mengandung E. coli

Peryaratan air bersih

Bebas bakteri patogen dan E. coli

FLORA NORMAL UDARA, KULIT
DAN MULUT
Udara
 buka tutup lempeng agar, letakkan pada
meja praktikum, biarkan terbuka selama
5 -10 menit
 tutup kembali, inkubasi terbalik selama
24 jam pada suhu 35o C
 amati jumlah koloni yang ada dan
lakukan pewarnaan gram
TANGAN
 lempeng agar dibagi menjadi dua bagian
 letakkan 3 jari pada bagian I dari lempeng
agar
 cuci tangan dengan sabun , keringkan
dengan kasa steril, letakkan 3 jari pada
bagian II lempeng agar
 tutup kembali, inkubasi terbalik selama 24
jam pada suhu 35o C
 amati jumlah koloni yang ada dan lakukan
pewarnaan gram
Mulut
Cara Kerja I
 lempeng agar di buka
 hembuskan udara nafas melalui mulut sebanyak 3
 tutup kembali, inkubasi terbalik selama 24 jam pada suhu
35o C
 amati jumlah koloni yang ada dan lakukan pewarnaan
gram
Cara kerja II
 ambil spesimen kotoran gigi menggunakan tusuk gigi
steril
 buat preparat kotoran gigi pada kaca objek dan fiksasi
dengan pemanasan
 warnai dengan pewarnaan Gram, gambarkan hasil
pengamatan yang diperoleh
KEPEKAAN KUMAN TERHADAP
ANTIBIOTIKA
Cara cakram (dish methode)
 Dipakai cakram kertas yang telah
mengandung antibiotika dengan kadar
tertentu dan diletakkan di atas lempeng agar
yang telah ditanami kuman. Diameter zona
hambatan pertumbuhan kuman yang tampak
menununjukkan ensitivitas kuman tersebut
terhadap antibiotika yang bersangkutan.
Cara tabung ( tube dilution methode)
 Dalam hal ini dibuat berbagai konsentrasi
antibiotika dan dicari konsentrasi terendah
yang masih dapat menghambat pertumbuhan
kuman.
CARA CAKRAM
 buat suspensi antibiotika dengan kadar tertentu
 buat supensi bakteri dengan kekeruhan
McFarland 0.5
 celupkan kapas steril kedalam suspensi bakteri,
usapkan kapas pada lempeng Muller Hinton
Agar hingga merata. Biarkan suspensi
mengering 4 – 5 menit
 letakkan cakram steril pada lempeng agar,
teteskan pada cakram steril larutan antibiotika
sebanyak 20 ul
 inkubasi pada suhu 35o C selama 18 – 24 jam
 perhatikan ada tidaknya zona hambat yang
terbentuk disekitar cakram