Pembuatan Media, Isolasi dan Pengamatan Cendawan

A. Tujuan
Dapat mengetahui pembuatan media tumbuh bakteri, cara isolasi, serta
mengetahui bentuk bakteri baik secara mikroskopis maupun makroskopis berdasarkan
sampel yang telah dibuat.
B. Kajian Materi
Bakteri adalah organisme bersel tunggal terkecil, beberapa di antaranya hanya
memiliki diameter 0,4 mm. Sel berisi massa sitoplasma dan beberapa bahan inti (dia tidak
memilki inti sel yang jelas). Sel dibungkus oleh dinding sel dan pada beberapa jenis
bakteri dinding sel ini dikelilingi oleh lapisan lendir atau kapsula. Kapsula terdiri atas
campuran polipeptida dan polisakarida (Gaman dan Sherrington, 1992) .
Bakteri merupakan sel prokariotik dan mempunyai berbagai bentuk besar
berbentuk batang dengan lebarm dan panjang 5yang sebagian m. kurang dari 1 DNA
diselubungi oleh satu membran inti, terdapat organela mitokondria dan protoplas. Daerah
inti berupa anyaman benang halus yang langsung berbatasan dengan sitoplasma berisi
ribosom.Bakteri berkembang biak dengan membelah diri (Schlegel, 1994).
Berdasarkan bentuk morfologisnya, maka bakteri itu dapat dibagi atas tiga
golongan,yaitu golongan basil, golongan kokus, dan golongan spiral. Basil (bacillus)
berbentuk serupa dengan tongkat pendek, silindris.Sebagian besar dari bakteri itu
merupakan basil. Basil dapat bergandeng-gandengan panjang, bergandengan dua-dua,
atau terlepas satu sama lain. Yang bergandeng-gandengan panjang disebut streptobasil,
yang dua-dua disebut diplobasil. Ujung-ujung basil yang terlepas satu sama lain itu
tumpul, sedang ujung-ujung yang masih bergandengan itu tajam. Kokus (coccus) adalah
bakteri yang bentuknya serupa bola-bola kecil.Golongan ini tidak sebanyak golongan
basil.Kokus ada yang bergandeng-gandengan panjang serupa tali leher, ini disebiut
streptokokus, ada yang bergandengan dua-dua, ini disebut tetrakokus, kokus yang
mengelompok merupakan suatu untaian disebut stafilokokus, sedang kokus yang
mengelompok serupa kokus disebut sarcina.Spiril (dari spirilum) ialah bakteri yang
bengkok atau berbengkok-bengkok serupa spiral.Bakteri yang berbentuk spiral itu tidak
banyak.Golongan ini merupakan golongan yang paling kecil, jika dibandingkan dengan
golongan kokus maupun golongan basil.(Dwijoseputro, 1978).
C. Alat dan Bahan
1. Alat
- Mikroskop Binokular
- Pipet tetes
- Tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Plastic tahan panas
- Cawan petri
- Object glass
- Cover glass
- Gelas beker
- Erlenmeyer schoot
- Jarum Ose bulat dan tajam
- Hot plate
- Autoclave
- Oven
- Batang pengaduk
- Kamera
- Tissue
- Kapas
- Masker
- Jas Lab
- Alat tulis
- Karet
2. Bahan
- Air Danau Tolire
- Aquades
- Alkohol
- Larutan Kristal violet, lugol, safranin
- Methyl Red, Methyl blue
 - Barit a, Barit b
- Simon sitrat-, TSIA, gelatin, motiliti, NA, SkimMilk, larutan H2O2
- Agar-Agar
- Kornet
- Gula
D. Prosedur kerja
1. Pembuatan Media NA (Natrium Agar)
a. Menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan.
b. Menimbang 6 gr gula, 6 gr Agar, 30 gr daging dan 150 mL air.
c. Memasukan gula dan agar yang telah ditimbang Erlenmeyer schoot, lalu
memasukan 30 gr daging kedalam gelas beker dan tambahakan 50 mL air.
d. Memanaskan daging tersebut hingga mendidih sambil diaduk menggunakan
batang pengaduk.
e. Setelah itu, saring daging menggunakan kapas di gelas beker yang lain dan
meremas hingga airnya keluar.
f. Memasukan air yang telah diperas kedalam Erlenmeyer schoot berisi gula dan
agar tadi, lalu menambahkan air hingga terisi 100 mL.
g. Memanaskan kembali Erlenmeyer schoot ke hotplate hingga larut atau homogen.
h. Kemudian, memasukan Erlenmeyer schoot pada autoclave untuk disterilkan
selama 20 menitengan suhu 121°
i. Di samping itu, mensterilkan 5 cawan petri dengan alcohol lalu masukan kedalam
oven selama 1,5 jam dengan suhu 100°.
j. Menuangkan masing-masing 30 mL larutan PDA kedalam cawan petri (Ingat
pengerjaan selalu dekat dengan api). Kemudian Media NA diberi kode 10−1
sampai10−5 tetapi media NA 10−3 disimpan untuk digunakan membuat biakan
baru dari teknik pengenceran.
2. Pengenceran Nacl
a. Menimbang 0,8 gr Nacl
b. Melarutkan 0,8 gr Nacl kedalam aquades sebanyak 100 mL
c. Mengaduk hingga larutan homogeny
 d. Menuang pada 7 tabung reaksi, masing-masing sebanyak 9 mL larutan Nacl, lalu
beri label 10−1 sampai 10−7 .
e. Memasukan tabung reaksi pada plastic tahan panas dan ikat menggunakan karet.
f. Sterilisasi pada autoclave selama 20 menit dengan suhu 121°.
3. Isolasi Cendawan Teknik Pengenceran
a. Menyiapkan lat dan bahan yang diperlukan
b. Mengambil 1 ml sampel air danau tolire dengan mikropipet lalu memasukkannya
ke dalam tabung reaksi kode 10−1 lalu campur hingga larutan homogen.
c. Memasukan larutan dari tabung 10−1 ke tabung 10−2 sebanytak 1 mL kemudian
campur kembali hingga larutan homogen. Lakukan perlakuan yang sama hingga
tabung ke 10−7
d. Memindahkan 0,1 mL larutan dari tabung 10−1 ke media NA kode 10−1 (sesuai
dengan kode yang sama) menggunakan mikropipet tepat ditengah media.
e. Menggores menggunakan ose bulat pada media NA secara zigzag disatu sisi
cawan petri dimulai dari tengah media, lalu putar 30° cawan petri dan gores
kembali. Lakukan hal yang sama pada tabung berikutnya.
f. Wrapping media dan inkubasi selama 24 jam. Lalu amati pertumbuhan bakteri
secara makroskopis.
g. Setelah pengamatan makroskopis, Mengambil salah-satu isolate bakteri dan
menggores kembali koloni bakteri dari isolate sebelumnya ke media NA yang
baru, lalu inkubasi selama 24 jam (untuk digunakan pengamatan fisiologis
biokimia)
4. Pengamatan Fisiologis Biokimia
a. Uji MR
1) Menyiapkan media MR yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni baktreri yang telah tumbuh pada media NA biakan baru
menggunakan ose bulat lalu dimasukan kedalam media MR dan diaduk
sebentar.
3) Biarkan selama 3 hari
4) Setelah itu, menetesi media MR dengan reagen Methyl Red sebanyak 2-3
tetes, lalu sedikit dikocok agar tercampur. tutup kembali dengan kapas.
 5) Lihat perubahan warna yang terjadi, jika berwarna pink samapai merah berarti
positif, namun jika tidak mengalami perubahan warna tetap kuning berarti
negatif.
b. Uji VP
1) Menyiapakan media MR yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni baktreri yang telah tumbuh pada media NA biakan baru
menggunakan ose bulat lalu dimasukan kedalam media MR dan diaduk
sebentar.
3) Biarkan selama 3 hari.
4) Setelah itu, menetesi media MR dengan barit a sebanyak 10 tetes, lalu tetesi
lagi dengan barit b sebanyak 5 tetes, tutup kembali dengan kapas.
5) Lihat perubahan warna yang terjadi, jika berwarna merah tua berarti positif,
namun jika tidak mengalami perubahan warna atau tetap kuning berarti
negatif.
c. Uji Sitrat
1) menyiapkan media sitrat yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni bakteri menggunakan ose bulat dari biakan lalu menggores
pada media sitrat dibagian zona miring secara zigzag, tutup kembali dengan
kapas.
3) Biarkan sampai 24 jam.
4) Mengamati perubahan warna yang terjadi. Jika media berubah warna menjadi
biru maka positif, namun jika warnanya tetap hijau berarti negatif.
d. Uji TSIA
1) Menyiapkan media TSIA yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni bakteri menggunakan ose bulat dari biakan lalu menggores
pada media TSIA dibagian zona miring secara zigzag, tutup kembali dengan
kapas.
3) Biarkan sampai 24 jam.
4) Mengamati perubahan warna yang terjadi dan catat hasilnya.
e. Uji Gelatin
1) Menyiapkan media gelatin yang telah dibuat.
 2) Mengambil koloni bakteri dari biakan menggunakan ose tajam lalu
menusuknya pada media gelatin secara tegak lurus
3) Biarkan sampai 24 jam.
4) Memasukan media gelatin kedalam lemari pendingin selama 30 menit lalu
keluarkan, jika media gelatin tetap cair berarti positif sebaliknya jika media
gelatin padat berarti negative.
5) Catat hasilnya.
f. Uji Motiliti
1) Menyiapkan media Motiliti yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni bakteri dari biakan menggunakan ose tajam lalu
menusuknya pada media motiliti secara tegak lurus sedalam 1 cm.
3) Biarkan sampai 24 jam.
4) Mengamati perubahan yang terjadi, jika koloni bakteri pada media motiliti
tumbuh kebawah melewati 1 cm berarti bakteri memiliki flagel, jika tetap
berarti tidak memiliki flagel..
5) Catat hasilnya.
g. Uji Pati
1) Menyiapkan media Pati yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni bakteri menggunakan ose bulat dari biakan lalu menggores
pada media pati secara zigzag.
3) Biarkan sampai 24 jam dan koloni bakteri tumbuh.
4) Menetesi reagen lugol diseluru permukaan media pati.
5) Lihat apabila terdapat zona bening yang tidak bisa terkena lugol berarti positif
jika tidak berarti negatif.
h. Uji Skim Milk
1) Menyiapkan media Skim Milk yang telah dibuat.
2) Mengambil koloni bakteri menggunakan ose bulat dari biakan lalu menggores
pada media pati secara zigzag.
3) Biarkan sampai 24 jam dan koloni bakteri tumbuh.
4) Lihat apabila terdapat zona bening berarti positif jika tidak berarti negatif.
i. Uji Katalase
 1) Menyiapkan Kaca preparat dan larutan hydrogen peroksida
2) Menetesi 1-2 tetes larutan hydrogen peroksida pada kaca preparat yang
sebelumnya telas disterilisasi denghan alcohol dan memfiksasinya
3) Mengambil koloni bakteri menggunakan ose bulat dari biakan lalu masuan
kedalam larutan hydrogen peroksida dikaca preparat sambil aduk secara
melingkar.
5) Amati perubahan yang terjadi jika terdapt busa berarti bakteri tersebut positif
jika tidak berate negatif.
5. Pewarnaan Gram
a. Menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan.
b. Menyiapkan preparat yang telah steril lau difiksasi.
c. Menetesi 1 tetes dengan aquades steril pada kaca preparat.
d. Membuat preparat oles menggunakan ose bulat sampai rata, lalu diamkan sampai
kering.
e. Meletakkan preparat pada bak pengering yang ada jarring.
f. Menetesi dengan gram A Kristal violet, lalu diamkan sampai 2 menit kemudian
tetesi dengan aquades.
g. Menetesi dengan gram B lugol, lalu diamkan sampai 2 menit kemudian tetesi
dengan aquades.
h. Menetesi dengan gram C alcohol 96%, kemudian langsung tetesi dengan aquades
i. Menetesi dengan gram D Safranin, lalu diamkan sampai 1 menit kemudian tetesi
dengan aquades.
j. Mengamati perubahan warna yang terjadi, jika berwarna ungu berarti bakteri
gram positif jika berwarna merah berarti bakteri gram negative.
k. Mengamati preparat dibawah mikroskop (pengamatan mikroskopis).
E. Hasil Pengamatan
1. Pengamatan Makroskopis
Identitas : Air danau tolire
Kode Isolat : NA 10−1 baru
Umur Biakan : 24 jam
a. Berdasarkan isolate bakteri pertama dengan teknik pengenceran

Cawan Petri Jumlah Koloni Jumlah Sel

10
−1
36 3,6 x 102 atau 360
10
−2
10 10 x 102 atau 1000
10
−4
Tidak ada Tidak ada
10−5 2 2000 x 102 atau 200.000

b. Berdasarkan isolate biakan baru

No Karakter yang Diamati Keterangan

1 Bentuk Koloni Bundar
2 Warna Koloni Cream
3 Tepian Koloni Smooth (Rata)
4 Elevasi Cembung
5 Sifat Koloni Berlendih, keruh

2. Pengamatan Fisiologis Biokimia

Uji Fisiologis Perubahan

No Hasil
Biokimia Warna/bentuk

1 Uji MR Merah +

2 Uji VP Merah +
3 Uji Sitrat Biru +

Bagian miring merah,

4 Uji TSIA +
bagian bawah kuning

5 Uji Gelatin Memadat -

6 Uji Motiliti Koloni memanjang +

7 Uji Pati Ada zona bening +

Uji Skim
8 Ada zona bening +
Milk
9 Uji Katalase Berbusa +
 3. Pengamatan Mikroskop Pewarnaan Gram

Karakteristik
Keterangan Gambar Dibawah Mikroskop
Bakteri
Bentuk sel Basil

Penataan Monobasil

Basil
Warna sel biru

4.
F. Pembahasan
berdasarkan tabel pengamatan pengamatan makroskopis biakan bakteri diperoleh hasil
pada tabung pertama jumlah koloni sebanyak 36 dengan jumlah sel 360 sel. Untuk tabung
kedua diperoleh koloni sebanyak 10 dengan jumlah sel 1000. Sementara pada tabung
kelima terdapat dua koloni dengan jumlah sel sebanyak 200.000 sel. Sedangkan pada
tabung keempat tidak terdapat koloni maupun sel bakteri.
Sementara berdasarkan tabel pengamatan makroskopis dengan biakan baru diperoleh
hasil bentuk koloni bundar warna koloni cream, tepiannya halus, elevasinya cembung,
sifat koloni berlendir dan keruh.
Berdasarkan tabel pengamatan bakteri secara mikroskopis diperoleh hasil uji MR +
artinya bakteri dapat memfermentasi glukosa, uji VP + artinya bakteri selain dapat
memfermentasi glukosa juga menghasilkan asam karbinol. Uji sitrat + artinya bakteri
mengunakan sitrat sebagai sumber karbon. Uji TSIA + artinya bakteri dapat
memfermentasi glukosa tetapi pertyumbuhan bakteri lambat. Uji Gelatin _ artinya bakteri
tidak dapat nenghidrolisisi gelatin. Uji Motiliti + artinya bakteri memiliki flagel sebagai
alat gerak. Uji pati + artinya bakteri dapat menghidrolisis pati. Uji skim milk + artinya
bakteri menghasilkan enzimprotease. Sementara uji katalase + bakteri dapat
mendegradasi H2O2. Untuk pewarnaan gram diperoleh hasil bakteri gram positif karena
hasil uji berwarna ungu dan pada pengamatan dibawah mikroskop baketri berbentuk basil
dengan penataan monobasil.
G. Kesimpulan
- Tabung kelima yang memiliki jumlah sel terbanyak yaitu 200.000 sel sedangkan
jumlah sel terkecil sebanyak 360 sel dimiliki oleh tabung pertama.
- Semua uji fisiologis biokimia adalah hasil positif kecuali uji gelatin
- Hasil pewarnaan gram adalah bakteri gram positif.
 DAFTAR PUSTAKA

Andre. 2016.” Perhitungan Jumlah Bakteri”.

https://www.researchgate.net/publication/317546865_ISOLASI_Rhizopus_oligosporus_
PADA_BEBERAPA_INOKULUM_TEMPE_DI_KABUPATEN_BANYUMAS
(diakses pada 19 Januari 2019)

Rere. 2016.”Laporan Biologi Bentuk Bakteri“.

https://rereclaudiamufc28.blogspot.com/2016/05/laporan-biologi-bentuk-bakteri.html
(diakses pada 19 Januari 2019).

Anggi. 2013. “Laporan Praktikum Mikrobiologi Khamir”.

https://www.academia.edu/11347783/Laporan_Praktikum_Mikrobiologi (diakses pada
19 Januari 2019).