III.

METODELOGI PRAKTIKUM
3.3 Metode
3.3.1 Pembuatan Vaksin
3.3.1.1Sterilisasi Alat
1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan,
2) Alat dicuci dengan air mengalir hingga bersih, kemudian dikeringkan,
3) Alat yang sudah kering disemprot menggunakan alcohol dan dikeringkan Kembali,
4) Alat dimasukkan dalam plastic tahan panas dan di autoklaf dengan suhu 121 oC selama
15-20 menit,
5) Alat yang sudah steril di diamkan hingga tidak terlalu panas dan dimasukkan kedalam
wadah steril agar terhindar dari kontaminasi bakteri,
6) Hasil.

3.3.1.2 Pembuatan Media TSA

1) 8 gr media TSA dimasukkan kedalam Erlenmeyer, kemudian ditambahkan aquades
sebanyak 200 ml,
2) Erlenmeyer dipanaskan dalam hotplate selama 40 menit hingga mendidih,
3) Media di diamkan selama 10-15 menit hingga tidak terlalu panas,
4) Media dipindahkan dalam 10 cawan petri dengan ketebalan 1/3,
5) Cawan petri dimasukkan dalam kertas, kemudian dimasukkan dalam kulkas selama
24 jam,
6) Hasil.

3.3.1.3 Pembuatan Media TSB

1) 6 gr media TSB dimasukkan dalam Erlenmeyer, kemudian ditambahakan aquades
sebanyak 200 ml,
2) Erlenmeyer dipanaskan menggunakan hotplate selama 40 menit hingga mendidih,
3) Media di diamkan selama 10-15 menit hingga hangat kuku,
4) Media dimasukkan dalam tabung reaksi,
5) Tabung reaksi ditutup menggunakan kapas, kasa, dan alumunium foil, kemudian
dimasukkan dalam plastic tahan panas,
6) Media di autoklaf dengan suhu 121oC selama 15-20 menit agar bakteri mati,
7) Inkubasi selama 24 jam,
8) Hasil.

3.3.1.4 Strik Bakteri

1) Laminar disterilkan menggunakan alcohol,
2) Jarum ose diambil kemudian dibakar ke Bunsen hingga kemerahan,
3) Jarum ose didiamkan 20 detik hingga tidak terlalu panas,
4) Cawan petri diambil dan bagian luar dipanaskan dengan Bunsen secara memutar,
 5) Dari empat kuadran bakteri, diambil satu kuadran dengan bakteri terbanyak dengan
cara digores pelan menggunakan jarum ose agar media tidak rusak,
6) Cawan petri ditutup Kembali dan di strik ke media TSA dengan pola satu kuadran
penuh,
7) Cawan petri di tutup dan diletakkan secara terbalik,
8) Setelah selesai, jarum ose dibakar hingga ujung,
9) Cawan petri dibungkus dengan plastic wrap dan diberi label dengan format jenis
bakteri dan waktu penanaman,
10) Cawan petri dimasukkan dalam pastik tanam panas dan dimasukkan dalam incubator
selama 1x24 jam,
11) Hasil.

3.3.1.5 Panen Bakteri ke Media TSB

1) Cawan petri dipanaskan menggunakan Bunsen,
2) Media TSA yang telah ditumbuhi bakteri ditambahkan PBS sebanyak 2-3 ml,
3) Media digores menggunakan cotton swab steril hingga semua bakteri rontok di
pinggir cawan petri,
4) Bakteri diambil dengan micropipet dan dipindahkan ke media TSB.
5) Erlenmeyer di tutup menggunakan kapas, kasa, dan alumunium foil,
6) Inkubasi selama 24 jam,
7) Hasil.

3.3.1.6 Inaktifasi Bakteri AgH

1) Bakteri diberi formalin 2% sebanyak 10 ml, kemudian ditutup menggunakan
alumunium foil.
2) Dihomogenkan hingga tercampur merata,
3) Inkubasi selama 24 jam,
4) Dilakukan uji viabilitas dengan media TCBS,
5) Jika bakteri masih dapat tumbuh maka dilakukan pemberian formalin Kembali dan
jika bakteri sudah tidak tumbuh maka dapat dilanjutkan proses pemanenan.
6) Hasil

3.3.1.7 Panen Bakteri dari Media TSB

1) Bakteri AgH Vibrio dipanen dari Erlenmeyer ke tabung corning,
2) Centrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 Rpm,
3) Supernatan dibuang dan sisakan pellet,
4) Pellet ditambahkan PBS sebanyak 5 ml dan dicuci dengan centrifuge selama 10 menit
kecepatan 3000 Rpm,
5) Supernatant dibuang dan sisakan pellet,
6) Pencucian dilakukan dua kali,
7) Pellet ditambahkan 2 ml PBS dan di homogenkan dengan vortex,
8) Semua bakteri dimasukkan dalam 1 tabung corning dan dimasukkan dalam kulkas,
 9) Hasil.

3.3.1.8 Kepadatan Bakteri

1) Kuvet di cuci menggunakan aquades,
2) Bakteri dalam tabung corning dimasukkan dalam kuvet sebanyak 1 ml,
3) Kuvet diletakkan dalam spektrofotometer untuk melihat kepadatan bakteri,
4) Spektrofotometer diatur dengan Panjang gelombang 625 nm dengan kepadatan 10 8
CFU/cell,
5) Bakteri diencerkan menggunakan aquades dengan rumus pengenceran,
6) Disiapkan 1 ml PBS dalam satu tabung corning,
7) Bakteri diambil 16 µL menggunakan micropipet dan dipindahkan dalam tabung
corning yang terisi PBS,
8) Hasil.

3.3.1.9 Injeksi Vaksin

1) Vaksin diambil menggunakan spuit 1 cc,
2) Injeksi vaksin pada secara intra peritorial sebanyak 1 ml per ikan,
3) Injeksi vaksin dilakukan 2 kali pada hari pertama dan hari ke-14,
4) Ikan diamati selama 21 hari dan dicatat gejala klinisnya,
5) Hasil.

3.3.2 Titer Antibodi

3.3.2.1 Pengambilan Darah
1) Darah ikan diambil menggunakan spuit 1 cc pada bagian linea literalis ikan,
2) Darah yang telah terambil didiamkan miring selama 24 jam dalam suhu ruang untuk
memisahkan darah dan serum darah,
3) Sampel darah dipindahkan dalam tabung corning dan dicentrifuge,
4) Setelah serum darah terpisah, diambil serum darah dengan micropipet dan pindahkan
ke tabung corning baru yang telah dilabeli,
5) TSB yang di waterbath selama 45 menit,
6) TSB dimasukkan dalam masing-masing tabung serum,
7) Semua tabung di centrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 Rpm,
8) Supernatan dibuang dan sisakan pellet,
9) Tabung ran rak diletakkan dalam kulkas,
10) Hasil.

3.3.2.2 Titer Antibodi

1) Disiapkan microplet yang telah dilabeli,
 2) Sumuran 1 dan 2 diisi serum 25 µL,
3) Sumuran 2-12 diisi PBS 25 µL,
4) Sumuran 2 diencerkan dengan bantuan micropipet,
5) 25 µL larutan pada sumuran 2 diambil dan dimasukkan pada sumuran 3,
6) Langkah 4 dan 5 dilakukan Kembali pada sumuran 3-11,
7) Larutan terakhir hasil pengenceran sumuran 11 dibuang,
8) Ditambahkan antigen 25 µL pada seluruh sumuran yang telah diencerkan,
9) Larutan dihomogenkan oada microplet dengan cara digoyangkan membentuk angka 8
selama 5 menit,
10) Microplate diinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam,
11) Microplet dimasukkan dalam refrigerator selama 24 jam,
12) Diamati aglutinasi yang terbentuk,
13) Hasil.

3.3.3 Pembuatan Uji Tantang

1) Bakteri dikultur dalam media TSA dengan 1 kuadran penuh dan inkubasi selama 24
jam,
2) Bakteri dipanen dengan cotton swab dan penambahan PBS,
3) Bakteri dipindahkan dalam tabung corning dan dilakukan centrifuge,
4) Supernatant dibuang dan sisakan pellet,
5) Dilakukan 2 kali pencucian dengan centrifuge menggunakan penambahan PBS,
6) Bakteri dihomogenkan menggunakan vortex dengan penambahan 5 ml PBS,
7) Dilakukan perhitungan kepadatan bakteri menggunakan spektrofotometer dengan
Panjang gelombang 625 nm,
8) Dilakukan pengenceran pada bakteri dengan 10 ml PBS,
9) Diambil suspense bakteri dengan spuit 1cc,
10) Ikan diinjeksi menggunakan suspense bakteri sebanyak 1 ml secara intra muscular,
11) Ikan diamati dan dicatat perkembangannya,
12) Hasil.