BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis dan Desain Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimen dengan

desain penelitian melihat daya hambat bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL

terhadap pertumbuhan P.aeruginosa .

3.2 Populasi dan Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah BAL Lactobacillus

sp yang berada di Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor.

Sampel yang digunakan adalah isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus,

dan L.casei yang diperoleh dari Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian

Bogor.

Bakteri uji yang digunakan adalah isolat murni P.aeruginosa yang

diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Sekolah Farmasi Institut

Teknologi Bandung.

Kontrol yang digunakan adalah isolat murni Enterococcus faecalis yang

diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Sekolah Farmasi Institut

Teknologi Bandung. E.faecalis merupakan strain yang sensitif terhadap

bakteriosin.

15
 16

3.3 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Politeknik Kesehatan

Kementerian Kesehatan Bandung Jurusan Analis Kesehatan pada bulan Mei

sampai dengan bulan Juni 2014.

3.4 Rencana Pengumpulan Data

Data dalam penelitian ini merupakan data primer. Data primer tersebut

diperoleh dari hasil pengamatan daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan

P.aeruginosa melalui pemeriksaan laboratorium yaitu dengan melakukan uji

aktivitas antibakteri bakteriosin baik secara tunggal (tahap 1) maupun kombinasi

dari ketiga Sampel Lactobacillus (tahap 2). Pertimbangan kombinasi tersebut

berdasarkan spektrum hambatan bakteriosin yang terbesar yang diperoleh dari

hasil penelitian tahap 1.

Penelitian ini menggunakan dua metode yaitu metode difusi sumur (hole

methode) dan metode mikrodilusi. Pengujian daya hambat bakteriosin terhadap

pertumbuhan P.aeruginosa masing-masing dilakukan sebanyak 3 kali (triplo).

3.4.1 Alat dan Bahan

3.4.1.1 Alat

Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :

- Cawan petri

- Tabung reaksi

- Ose
 17

- Spirtus

- Objek glass

- Erlenmeyer 250 mL

- Gelas kimia 500 mL

- Gelas ukur 100 mL

- Pipet ukur 10 mL

- Mikropipet

- Tip biru

- Tip kuning

- Milipore ø 0,22 μm

- Corong kecil

- Tabung ependorf

- Inkubator

- Oven

- Autoclave

- Neraca teknis

- Jangka sorong

- Ultra centrifuge

3.4.1.2 Bahan

Adapun bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah :

- Isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei.

- Isolat murni P.aeruginosa

 18

- Isolat murni E.faecalis

- Media Mac Conkey agar

- Media Mueller Hinton agar dan Mueller Hinton broth

- NaCl fisiologis steril

- Aquades steril

- Media MRS agar miring dan MRS broth

- Media uji biokimia gula-gula panjang (Glukosa, Laktosa, Manitol,

Maltosa, Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat, dan Semi

solid)

- Larutan BaCl2 1%

- Larutan H2SO4 1%

- Reagen zat pewarnaan Gram

3.4.2 Cara Kerja

3.4.2.1 Persiapan Penelitian

1) Sterilisasi Alat

Dicuci bersih semua alat-alat gelas yang digunakan dalam

penelitian, kemudian dikeringkan lalu dibungkus dengan kertas coklat

dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 180o C selama 1 jam atau

pada suhu 160o C selama 2 jam.

2) Pembuatan Media Mueller Hinton Agar

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) agar adalah dengan cara

dilarutkan 38 gram bubuk MH agar dengan 1 liter aquades ke dalam

 19

labu erlemneyer, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH

disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121o C.

kemudian diangkat dan tunggu sampai suhu media ± 40 o C lalu

dituangkan ke dalam cawan petri dengan jumlah tuangan ± 20 mL

pada setiap cawan petri secara aseptik.

3) Pembuatan Media Mueller Hinton Broth

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) broth adalah dengan cara

dilarutkan 38 gram bubuk MH broth dengan 1 liter aquades ke dalam

gelas kimia, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH broth

kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi masing-masing

sebanyak 10 mL kemudian ditutup dengan kapas kassa lalu dibungkus

dengan kertas coklat. Media MH broth disterilkan dalam autoclave

selama 15 menit pada suhu 121o C kemudian diangkat.

4) Pembuatan Standar Mc Farland 0,5

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering dan steril, kemudian

diisi larutan asam sulfat (H2SO4) 1% sebanyak 9,95 mL dan Larutan

barium klorida (BaCl2) 1% sebanyak 0,05 mL kemudian dikocok.

Endapan barium sulfat (BaSO4) yang terbentuk dalam tabung setara

dengan jumlah bakteri 1,5 x 108 CFU/mL.

5) Pembuatan Bakteriosin

Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei masing-masing

ditanam pada MRS broth, kemudian diinkubasi pada suhu 35o C

selama 48 jam. Kemudian suspensi tersebut disentrifugasi 8000 rpm

 20

selama 30 menit pada suhu 4o C, kemudian supernatan yang terbentuk

disaring dengan milipore filter ø 0,22 μm dan filtrat yang didapatkan

merupakan bakteriosin.

6) Pembuatan Suspensi P.aeruginosa

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering, dan steril kemudian

dimasukkan NaCl fisiologis masing-masing sebanyak 10 mL. Diambil

menggunakan ose beberapa koloni bakteri dari biakan murni

P.aeruginosa kemudian dicampur dalam tabung reaksi sampai

homogen, lalu dibandingkan kekeruhan yang terjadi dengan standar

Mc Farland 0,5.

3.4.2.2 Prosedur Penelitian

1) Uji Penegasan

Isolat murni P.aeruginosa di isolasi pada media Mac Conkey agar,

diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh

diambil dengan ose lalu ditanam pada uji biokimia (Glukosa, Laktosa,

Manitol, Maltosa, Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat,

dan Semi solid) diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam kemudian

hasil penanaman diamati, dan dicocokkan dengan tabel. Koloni

bakteri yang tumbuh di media MC agar dibuat pulasan kemudian

diwarnai dengan pewarnaan Gram Setelah diwarnai, masing-masing

preparat tersebut diamati dibawah mikroskop dengan lensa objektif

100x menggunakan minyak imersi.

 21

2) Uji Penelitian

Metode : Difusi Sumur

- Disiapkan alat dan bahan yang deperlukan.

- Dengan menggunakan lidi kapas steril dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa yang setara dengan standar Mc Farland 0,5 pada

permukaan media MH agar secara merata dan aseptik.

- Dibuat lubang atau sumur dengan menggunakan tabung kecil steril

(ø ± 1 cm) pada MH agar yang telah dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa.

- Disiapkan sampel bakteriosin.

- Dipipet sampel bakteriosin dengan menggunakan mikropipet

sebanyak 50 μL kemudian dimasukkan ke dalam sumur.

- Dilakukan pengujian sebanyak 3 kali (triplo) pada setiap jenis

sampel yang sama.

- Dibuat kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-).

- Diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam dalam inkubator.

- Diamati ada tidaknya zona hambat yang terbentuk terhadap

pertumbuhan P.aeruginosa di sekitar sumur.

- Zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong dan

dicatat diameter zona hambat yang terbentuk.

Metode : Mikrodilusi

- Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan

 22

- Dipipet suspensi P.aeruginosa sebanyak 5 μL menggunakan

mikropipet ditambahkan ke dalam 10 mL Nutrien Broth lalu

dihomogenkan.

- Disiapkan 12 tabung reaksi yang bersih, kering, dan steril. Dipipet

sebanyak 100 μL MH broth kemudian dimasukkan pada tabung 1

sebagai kontrol negatif (-).

- Pada tabung 2-12 dimasukkan sebanyak 100 μL suspensi bakteri

P.aeruginosa.

- Tabung 3 ditambahkan 100 μL sampel bakteriosin kemudian

dihomogenkan.

- Dari tabung 3 diambil 100 μL kemudian dipindahkan ke tabung 4

(pengenceran sampel bakteriosin). Pengenceran dilakukan sampai

tabung ke 12 yang memiliki konsentrasi terkecil.

- Tabung diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam, kemudian hasil

dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan adalah

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM).

- Sebanyak 5 μL setiap bagian jernih dipindahkan pada MH agar,

diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam, kemudian hasil dibaca.

Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan adalah

Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM).

 23

1. Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji yang tumbuh pada media uji dilakukan dengan

pewarnaan Gram dengan langkah kerja sebagai berikut :

1. Disediakan kaca objek bersih dan kering

2. Diteteskan larutan NaCl fisiologis pada masing-masing kaca objek.

3. Secara aseptik, diambil masing-masing koloni bakteri dengan ose

lalu dipindahkan pada kaca objek dan dihomogenkan dengan larutan

NaCl fisiologis.

4. Apusan dibiarkan kering di udara kemudian difiksasi.

5. Diteteskan zat warna kristal violet pada apusan dan didiamkan

selama satu menit.

6. kemudian dibilas dengan air

7. Apusan digenangi dengan lugol, didiamkan selama satu menit.

8. Kemudian dibilas dengan air.

9. Apusan dialiri dengan alkohol 95% tetes demi tetes selama 20 detik

sampai zat warna kristal violet luntur.

10. Kemudian dibilas dengan air.

11. Apusan kemudian digenangi dengan zat warna tandingan yaitu

safranin selama satu menit

12. Kemudian dibilas dengan air.

 24

13. Kaca objek dikeringkan dengan kertas hisap secara hati-hati.

Setelah diwarnai, masing-masing preparat tersebut diamati

dibawah mikroskop dengan lensa objektif 100x menggunakan minyak

imersi untuk meyakinkan bakteri yang tumbuh pada media uji sesuai

dengan bakteri yang diisolasikan.

 25

Sterilisasi alat

Pembuatan media uji

Media uji kaldu tutut

dengan konsentrasi 2%, Media standar
3%, 4%, dan 5%. nutrient agar

Isolasi bakteri uji

inkubasi suhu 370C selama 24 jam

Identifikasi bakteri uji

Makroskopis : Mikroskopis :
Pertumbuhan koloni bakteri pada Pewarnaan Gram
media uji dan media standar

Gambar 3.1 Skema Cara Kerja

 26

2-5 gram daging tutut + 100 ml 2-5 gram daging tutut + 100 ml
aquadest. Direbus sampai menjadi aquadest. Direbus sampai menjadi
kaldu + 100 ml aquadest lalu kaldu + 100 ml aquadest lalu
disaring. disaring.

Di ukur pH, dibuat sekitar pH 7

Masing-masing + 1,5 gram agar bubuk

Dihomogenkan dan dipanaskan sampai mendidih

Disterilisasi pada suhu 1210C selama 15 menit

2% 3% 4% 5% NA

Diisolasikan suspensi bakteri uji pada media

Dilakukan pengamatan hasil isolasi

Gambar 3.2 Skema Pembuatan Media

 27

3.5 Rencana Analisis Data

Analisis data hasil penelitian yang digunakan untuk mengetahui

konsentrasi media kaldu tutut yang terbaik untuk pertumbuhan Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli adalah dengan menggunakan uji statistik yaitu One

Way Anova Test.

3.6 Rencana Jadwal Penelitian

Rencana jadwal untuk penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai

berikut :

Tabel 3.2 Rencana Jadwal Penelitian

N
Kegiatan Des Jan Feb Mar Apr Mei Juni Juli
o
1. Studi pustaka
2. Bimbingan
Penyusunan
3.
proposal
4. Seminar penelitian
Persiapan
5.
penelitian
6. Persiapan sampel
7. Pemeriksaan lab
8. Pengumpulan data
9. Analisis data
10
Penyusunan KTI
.
11
Sidang KTI
.