VALIDASI EFEKTIVITAS DESINFEKTAN

1. Pengujian dalam Laboratorium

Berikut ini adalah metode yang dapat digunakan untuk pengujian efektivitas desinfektant
(Khaira, 2016) :

a) Carrier Test :
Pada uji ini menggunakan kain sutra yang sudah dikontaminasikan dengan kultur dari
mikroorganisme yang akan diuji. Setelah itu kain dikeringkan dan diberikan desinfektan
yang akan diuji dalam waktu tertentu. Hasilnya cukup dilihat pertumbuhan pada media
nutrien broth tersebut, apabila tidak terdapat pertumbuhan bakteri mengindikasikan bahwa
desinfektan uji efektif membunuh mikroorganisme tersebut.

Uji ini dilakukan berulang dengan konsentrasi yang berbeda dan waktu paparan yang
berbeda untuk menemukan konsentrasi terendah dan waktu tercepat yang dibutuhkan
desinfektan sehingga didapatkan rasio penggunaan desinfektan yang paling efektif.

Variable : Bebas : konsentrasi desinfektan, waktu paparan

Terikat : mikroorganisme, nutrient broth

b) Suspension Test
Uji suspensi merupakan salah satu uji desinfektan yang paling sederhana. Pada uji ini,
kultur bakteri dimasukkan kedalam larutan-larutan desinfektan yang telah diencerkan
dengan pengenceran tertentu yang berbeda-beda secara gradual. Hasilnya dilihat pada
pertumbuhan bakteri di media perbenihan nutrien broth yang telah diinkubasi.

Terdapat dua macam uji suspensi yaitu uji kualitatif dan kuantitatif. Uji kualitatif
digunakan untuk menentukan koefisien fenol dari desinfektan uji atau yang lebih dikenal
dengan metode Rideal-Walker. Selain metode Rideal-Walker, metode Chick-Martin juga
digunakan untuk menentukan nilai koefisien fenol namun Chick-Martin menggunakan
suspensi ragi atau feces sebagai pelarut desinfektannya, berbeda dengan Rideal-Walker
yang menggunakan aquades sebagai pelarut desinfektan. Koefisien fenol yang didapatkan
dari metode Chick-Martin cenderung lebih rendah dari nilai yang didapatkan dari metode
Rideal-Walker. Koefisien fenol desinfektan uji didapatkan dari perbandingan tingkat
pengenceran dan waktu bunuh antara desinfektan uji dengan fenol sebagai standar.

Pada uji kuantitatif, nilai Microbicidal effect (ME) ditentukan dengan membandingkan
jumlah bakteri yang masih hidup setelah paparan dengan desinfektan dengan total bakteri
sebelum terpapar dengan desinfektan. Nilai ME dianggap 1 apabila desinfektan mampu
membunuh 90% dari total bakteri sebelum terpapar desinfektan, sedangkan nilai ME
dianggap 2 apabila 99% jumlah bakteri total mati. Lazimnya desinfektan memiliki nilai
ME sama dengan atau melebihi 5, dimana nilai 5 menunjukkan 99,99% dari total bakteri
terbunuh.

c) Capacity Test
Pada uji ini, desinfektan diuji kapasitasnya dalam membunuh mikroorganisme dengan
penambahan bakteri secara bertahap kedalam larutan desinfektan. Kapasitas bakteri dilihat
dari kemampuannya membunuh bakteri yang terus ditambahkan hingga kemampuannya
dalam membunuh mikroorganisme menurun.
 d) Practical Test
Uji praktis ini dilakukan setelah melakukan uji kuantitatif suspensi desinfektan dan
mengetahui rasio konsentrasi dengan waktu bunuh. Tujuan dari uji ini adalah untuk
mengetahui apakah pengenceran paling efektif yang didapatkan dari uji kuantitatif tersebut
masih sesuai atau adekuat untuk membunuh mikroorganisme yang diuji dengan kondisi
sehari-hari. Uji praktis dilakukan dalam kondisi sehari-hari sedangkan uji suspensi
dilakukan didalam kondisi laboratorium. Metode uji praktis yang lazim digunakan adalah
surface test atau uji permukaan.

Uji ini menggunakan pipa Polyvinyl Chloride (PVC) atau stainless steel yang telah
dikontaminasi dengan biakan mikroorganisme uji dan dikeringkan. Setelah itu sejumlah
larutan desinfektan, dengan kadar pengenceran yang didapat dari uji suspensi, diratakan
pada permukaan yang telah dikontaminasi mikroorganisme. Setelah waktu yang
ditentukan, permukaan dibilas menggunakan air suling. Air suling hasil pembilasan
diinokulasi untuk melihat ada tidaknya mikroorganisme yang masih hidup.

e) In Use Test
Uji ini merupakan uji yang mudah dilakukan dan bertujuan untuk mendeteksi kontaminasi
pada desinfektan. Sampel desinfektan dicampur dengan pelarut dengan perbandingan 1:9.
Siapkan dua media perbenihan nutrien agar. 0,2 ml volume larutan diteteskan pada masing-
masing nutrien agar yang kemudian diinkubasi secara terpisah. Satu nutrien agar diinkubasi
pada suhu 37º C selama tiga hari, sedangkan nutrien agar lainnya diinkubasi

2. Skema metode yang akan digunakan dalam validasi

Dalam validasi dilakukan perhitungan koefisien fenol untuk menentukan efektifitas
desinfektan dengan menggunakan metode Suspension Test.

Variable yang digunakan dalam validasi :

- Variable bebas : Jenis larutan desinfektan, konsentrasi desinfektan, lama paparan
desinfektan
- Variable terikat : Pertumbuhan bakteri challenges, media pertumbuhan bakteri

Berikut ini adalah alat dan bahan yang dibutuhkan dalam validasi efektifitas desinfektan :

Alat : - Tabung reaksi - Inkubator

- Rak tabung - Oven
- Ose - Autoklaf
- Bunsen - Lemari Es
- Cawan petri
- Mikro pipet 1000 μl
- Tip 100 μl
- Pipet tetes
- Vortex
- Spatula besi
- Timbangan digital
- Gelas beker 500 ml
- Gelas ukur 100 ml
- Gelas ukur 10 ml
- Tabung erlenmeyer,
- Stopwatch
- Hot plate
- Stir Magnetik
Bahan : - Larutan desinfektan yang digunakan di Produksi (Fenol 2,5%, Alkohol 70% dan
IPA)
- Serbuk Fenol
- Nutrien agar (NA)
- Nutrien broth (NB)
- Larutan pengencer NaCl steril
- Larutan standar 0,5 Mc Farland
- Biakan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC
- Aquades steril
- Alkohol 70%

Langkah pengujian efektivitas desinfektan :

1. Persiapan Media Perbenihan
Media nutrien broth yang telah dimasak dimasukkan dalam 36 tabung reaksi ukuran 20 x
150 mm, masing-masing dengan volume 5 ml. Kemudian dilakukan sterilisasi
menggunakan autoklaf lalu diberi label masing-masing tabung dari a1, a2, a3, a4, a,5, a6,
begitupula untuk tabung selanjutnya b, c, d, e, dan f. Media nutrien agar yang telah
dimasak dilakukan sterilisasi terlebih dahulu menggunakan autolaf kemudian dituang
kedalam cawan petri masing-masing 20 ml.

2. Pembuatan Stock Bakteri

Pembuatan stok bakteri ini bertujuan untuk memperbanyak dan meremajakan bakteri uji,
yaitu Pseudomonas aeruginosa. Caranya dengan mengambil 1 ose biakan murni bakteri
Pseudomonas aeruginosa lalu ditanam pada media nutrien agar (NA) kemudian diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam.

3. Persiapan Sampel dan Standar Uji

Larutan pembersih lantai dan standar fenol 5 % disimpan dalam suhu ruangan dan tetap
ditutup rapat. Fenol serbuk dijaga agar terhindar dari paparan sinar matahari. Pengenceran
larutan desinfektan dengan kandungan Benzalkonium Klorida 1,5% menggunakan
aquades steril kedalam 6 konsentrasi yaitu 1/40, 1/60, 1/80, 1/100, 1/120, 1/140.
Pembuatan larutan fenol dengan cara mencampurkan fenol serbuk 5 gram dengan aquades
sampai volume keduanya mencapai 100 ml kemudian dilakukan pengenceran kedalam
enam konsentrasi seperti larutan desinfektan dan diberikan label pada masing-masing
tabung reaksi A, B, C, D, E, dan F.

4. Pengenceran Bakteri Uji

Siapkan tabung reaksi berisi 2 ml NaCl fisiologis 0,9% , kemudian tambahkan sebanyak 1
ose biakan Pseudomonas aeruginosa yang telah diremajakan satu hari sebelumnya
kedalam tabung tersebut. Setarakan kekeruhannya dengan larutan Mc. Farland III (108
kuman/ml) dengan menambahkan NaCl 0.9 % sesuai kebutuhan.

5. Tahap Pengujian
Percobaan dilakukan terhadap desinfektan dan fenol dengan menggunakan enam
konsentrasi yang telah disiapkan sebelumnya yaitu tabung A = 1/40, tabung B = 1/60,
tabung C = 1/80, tabung D = 1/100, tabung E = 1/120, tabung F = 1/140. Suspensi bakteri
Pseudomonas 108 kuman/ml yang telah disiapkan sebelumnya diambil sebanyak 0,2 ml
dan dimasukkan ke tabung A. Pemindahan ini menggunakan mikropipet agar volume
suspensi bakteri yang ditambahkan akurat dan dilakukan dalam keadaan aseptik untuk
menghindari terjadinya kontaminasi.
Uji dilanjutkan dengan menambahkan masing- masing satu ose suspensi bakteri
Pseudomonas aeruginosa kedalam tabung berisi nutrien broth 5 ml yang telah disterilisasi
 dan diberi label a1. Setelah interval 5 menit, masukkan satu ose suspensi bakteri pada
tabung berisi nutrien broth 5 ml dengan label a2, dan lakukan seterusnya hingga tabung a6
dengan interval antar tabung 5 menit. Pemindahan satu ose suspensi bakteri dilakukan
dengan menggunakan ose yang telah difiksasi diatas api dan ditunggu beberapa saat sampai
ose tidak terlalu panas agar bakteri yang dipindahkan tidak mati karena ose yang telalu
panas. Setiap selesai pemindahan bakteri dilakukan pencampuran dengan menggunakan
vortex.
Ulangi prosedur yang sama pada pengenceran-pengenceran lainnya. Selanjutnya tabung uji
diinkubasi pada suhu 37° C selama 20 jam. Pembacaaan hasil reaksi dinilai dari kekeruhan
pada setiap tabung. Jika hasil yang diperoleh adalah keruh (positif) maka menandakan pada
tabung ada pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa. Sedangkan jika tabung reaksi
bening (negatif) menandakan bahwa tidak ada pertumbuhan bakteri Pseudomonas
aeruginosa karena telah terbunuh oleh kandungan desinfektan.

3. Analisa Data
Dari hasil reaksi yang dilakukan, catat daya bunuh bakteri tercepat (menit ke- berapa dan
pengenceran ke berapa), serta catat daya bunuh bakteri terlama (menit ke- berapa dan
pengenceran ke berapa). Berikut ini contoh analisa data efektivitas desinfektan secara
kualitatif melalui perhitungan koefisien fenol dari sampel benzalkonium klorida :

Daya bunuh tercepat sampel benzalkonium klorida pada menit ke-5 pada pengenceran 1/60,
sedangkan daya bunuh terlama sampel benzalkonium klorida pada menit ke-30 pada
pengenceran 1/100.
Daya bunuh tercepat fenol 5% pada menit ke-5 pada pengenceran 1/100, sedangkan daya
bunuh terlama pada menit ke-30 pada pengenceran 1/120.

Untuk menghitung koefisien sampel menggunakan rumus sebagai berikut :

Koefisien Fenol = {(Cat : Cbt ) + (Cat' : Cbt')}/2

Keterangan : Cat : Pengenceran zat uji dengan waktu tercepat membunuh

Cbt : Pengenceran fenol dengan waktu tercepat membunuh
Cat' : Pengenceran zat uji dengan waktu terlama membunuh
Cbt' : Pengenceran fenol dengan waktu terlama membunuh

Nilai Koefisien Fenol :

< 1 : efektivitasnya lebih kecil dari fenol
= 1 : efektivitasnya sama dengan fenol
> 1 : efektivitasnya lebih besar dari fenol

Maka perhitungan untuk contoh data diatas adalah sebagai berikut :

Koefisien Fenol = {(60 : 100) + (100 : 120)}/2

= {0,6 + 0,83}/2
= 0,715

Dari hasil perhitungan contoh data diatas dapat disimpulkan bahwa benzalkonium klorida
efektivitasnya lebih kecil dari fenol. Efektivitas desinfektan juga dapat diuji secara
kuantitatif dengan menghitung microbicidal effect (ME) dengan cara membandingkan
jumlah bakteri yang masih hidup setelah terpapar desinfektan dengan jumlah bakteri
sebelum terpapar desinfektan (108 kuman/ml), perhitungan ME dapat dilakukan dengan
pengujian Total Plate Count (TPC).