MODUL 6.

UJI KOEFISIEN FENOL

A. TUJUAN
Mengevaluasi daya antimikroba suatu disinfektan dengan memperkirakan
potensi dan efektivitas disinfektan berdasarkan konsentrasi dan waktu kontak
terhadap mikroba serta membandingkannya terhadap fenol standar yang
disebut dengan koefisien fenol.

B. PRINSIP
Pertumbuhan bakteri uji pada media yang sesuai setelah bakteri tersebut kontak
dengan disinfektan selama 5, 10, dan 15 menit.

C. TEORI DASAR
Antibakteri adalah suatu bahan yang mengganggu pertumbuhan dan
metabolism bakteri, sehingga bahan tersebut dapat menghambat pertumbuhan
atau bahkan membunuh bakteri, seperti antiseptik dan disinfektan (Pelczar dan
Chan, 2005). Antiseptik merupakan zat yang digunakan untuk menghambat
pertumbuhan atau membunuh bakteri, sedangkan disinfektan adalah bahan
kimia yang dapat mematikan sel vegetatif bakteri tetapi belum tentu
mematikan sporanya (Isadiartuti dan Retno, 2005).
Ciri-ciri suatu disinfektan yang ideal adalah memenuhi hal-hal sebagai
berikut:
1. Aktivitas antimikrobial, pada konsentrasi rendah harus mempunyai
aktivitas
antimikrobial dengan spektrum luas.
2. Kelarutan, harus dapat larut dalam air atau pelarut lain sampai taraf yang
diperlukan untuk dapat digunakan secara efektif.
3. Stabilitas perubahan yang terjadi pada substansi bila dibiarkan beberapa
hari harus seminimal mungkin dan tidak boleh menghilangkan
antimikrobialnya secara nyata.
4. Tidak bersifat racun
5. Homogen
6. Tidak bergabung dengan bahan organik
7. Aktivitas antimikrobal pada suhu kamar
8. Tidak menimbulkan karat dan warna
9. Kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap
10. Memiliki kemampuan sebagai detergen
11. Tersedia dalam jumlah yang besar dengan harga yang pantas
Salah satu cara pengujian disinfektan yang umum digunakan di
laboratorium adalah metode pengenceran yang kekuatan disinfeksinya
dinyatakan sebagai koefisien fenol. Koefisien fenol adalah bilangan pecahan
yang menunjukan perbandingan kekuatan daya bunuh dari disinfektan
dibandingkan dengan kekuatan daya bunuh dari fenol sebagai pembanding
dalam kondisi yang sama, yaitu jenis bakteri yang sama dan waktu kontak yang
sama. Nilai koefisien fenol merupakan hasil bagi dari faktor pengenceran
tertinggi disinfektan dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang
masing-masing dapat membunuh bakteri uji dalam jangka waktu 10 menit,
tetapi tidak membunuh dalam jangka waktu 5 menit.
 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑖𝑛𝑔𝑔𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘 𝑑𝑒𝑠𝑖𝑛𝑓𝑒𝑘𝑡𝑎𝑛
𝑘𝑜𝑒𝑓𝑖𝑠𝑖𝑒𝑛 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 =
𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑖𝑛𝑔𝑔𝑖 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙

Nilai koefisien fenol kurang atau sama dengan 1 menunjukkan bahwa

efektivitas disinfektan yang diuji sama atau lebih kecil dari fenol. Sedangkan
jika nilai koefisien fenol lebih dari 1 menunjukkan bahwa disinfektan yang
diuji lebih efektif dibanding fenol.

D. ALAT DAN BAHAN

Alat: Tabung reaksi, kawat ose, labu ukur 50mL, pipet, inkubator, stopwatch,
pH meter
Bahan: Desinfektan uji, Spirtus, akuades steril, Fenol standar, larutan Mc
Farland III, Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), NaCl fisiologis 0,9%,
Mikroba uji: Bakteri Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa

E. PROSEDUR
Pembuatan Media
Nutrient Broth (NB) dibuat dengan melarutkan pepton 10 g, ekstrak
daging 5 g, dan NaCl 5 g dalam 1 liter air suling, pH akhir 6,8. Media NB
kemudian dimasukkan ke dalam 12 tabung reaksi ukuran 20 x 150 mm dengan
volume masing-masing 5 mL.
Pembuatan Inokulum
Bakteri Pseudomonas aeruginosa atau Staphylococcus aureus yang
sebelumnya telah ditanam pada agar nutrisi (Nutrient Agar) miring diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 - 48 jam. Tahap pengenceran bakteri uji:
1. Siapkan tabung reaksi berisi 2 mL NaCl fisiologis 0,9%
2. Pindahkan biakan P. aeruginosa atau S. aureus (pilih salah satu) ke
dalam larutan NaCl dengan kawat ose, dan setarakan kekeruhannya
dengan larutan Mc Farland III (109 mikroba/mL)
3. Suspensi bakteri tersebut kini diperkirakan berisi 109 mikroba/mL
4. Siapkan 3 buah tabung reaksi masing-masing berisi 4,5 mL NaCl fisiologis
0,9%
5. Pipet 0,5 mL dari suspensi mikroba sebelumnya (109 mikroba/mL),
pindahkan ke salah satu tabung reaksi berisi 4,5 mL NaCl. Suspensi
mikroba kini berkonsentrasi 108 mikroba/mL
6. Lakukan pengenceran kedua dengan mengambil 0,5 mL dari suspensi
mikroba 108 dan pindahkan ke dalam tabung berisi 4,5 NaCl yang kedua.
Suspensi mikroba kini berkonsentrasi107 mikroba/mL
7. Pengenceran terakhir dilakukan dengan memindahkan 0,5 mL dari
suspense mikroba 107 ke dalam tabung terakhir NaCl. Suspensi mikroba
telah setara dengan 106 mikroba/mL. Suspensi bakteri dengan konsentrasi
inilah yang akan digunakan untuk melakukan uji pada praktikum ini.
 Tahapan pengenceran bakteri uji

Pembuatan Baku Fenol

Dibuat larutan persediaan baku fenol 5% dengan cara menimbang 2,5 g fenol
dalam 50 mL air suling steril. Kemudian dilakukan pengenceran konsentrasi
menjadi 1:80 dengan mempipet 12,5 mL larutan fenol 5% ditambahkan dengan
37,5 mL air suling steril pada tabung steril ukuran 25 x 150 mm.

Tahapan pembuatan baku fenol

Pembuatan Larutan Disinfektan

Pengenceran larutan disinfektan dilakukan pada tabung steril berukuran 25 x
150 mm. Tahapannya adalah sebagai berikut:
1. Siapkan 4 buah tabung steril berisi air suling dengan volume yang berbeda-
beda, yaitu 9 mL; 7 mL; 4,5 mL; dan 7 mL, secara berurutan
2. Lakukan pengenceran pertama dengan mempipet 1 mL larutan disinfektan
ke dalam 9 mL air suling sehingga konsentrasi menjadi 1:10
3. Pengenceran selanjutnya adalah dengan memindahkan 1 mL disinfektan
1:10 ke dalam tabung berisi 7 mL air suling. Konsentrasi disinfektan pada
tabung ini adalah 1:80
4. Pindahkan 0,5 mL disinfektan 1:10 ke dalam 4,5 mL akuades sehingga
konsentrasi kini 1:100
5. Pipet 0,5 mL disinfektan 1:10 ke dalam tabung berisi 7 mL air suling
sehingga konsentrasi pada tabung ini adalah 1:150
6. Disinfektan yang akan dipakai selanjutnya adalah yang konsentrasinya 1:80,
1:100, dan 1:150. Oleh karena itu, samakan volumenya masing-masing
menjadi 5 mL.

Tahapan pengenceran desinfektan

Setelah media, bakteri uji, larutan fenol, dan disinfektan telah siap. Kita dapat
melakukan inokulasi mikroba uji dalam disinfektan dan fenol dengan
memperhitungkan waktu kontak 5, 10, dan 15 menit secara akurat. Beri label
12 tabung berisi Nutrient broth dengan menandai
F5’ DES 1:80 5’ DES 1:100 5’ DES 1:150 5’
F10’ DES 1:80 10’ DES 1:100 10’ DES 1:150 10’
F15’ DES 1:80 15’ DES 1:100 15’ DES 1:150 15’

UJI FENOL
Pipet inokulum konsentrasi 106 mikroba/mL sebanyak 0,5 mL ke dalam larutan
fenol 1:80. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke
dalam tabung berlabel F5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose dari
campuran tersebut ke dalam tabung F10’. Setelah lima menit kemudian, ambil
1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung F15’.
Uji Disinfektan 1:80
Pipet inokulum konsentrasi 106 mikroba/mL sebanyak 0,5 mL ke dalam
disinfektan 1:80. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut
ke dalam tabung berlabel DES 1:80 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1 ose
dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80 10’. Setelah lima menit
kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:80 15’.
Uji Diseinfektan 1:100
Pipet inokulum konsentrasi 106 mikroba/mL sebanyak 0,5 mL ke dalam
disinfektan 1:100. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut
ke dalam tabung berlabel DES 1:100 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1
ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:100 10’. Setelah lima menit
kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:100 15’.
Uji Disinfektan 1:150
Pipet inokulum konsentrasi 106 mikroba/mL sebanyak 0,5 mL ke dalam
disinfektan 1:150. Tunggu sampai 5 menit, ambil 1 ose dari campuran tersebut
ke dalam tabung berlabel DES 1:150 5’. Lima menit kemudian, ambil lagi 1
ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:150 10’. Setelah lima menit
kemudian, ambil 1 ose dari campuran tersebut ke dalam tabung DES 1:150 15’.

Tabung-tabung reaksi uji kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu

37°C selama 24 - 48 jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada
setiap tabung. Pengamatan cara inokulasi mikroba ke dalam disinfektan:
 (+)keruh : ada pertumbuhan
(-) jernih : tidak ada pertumbuhan

F. HASIL PENGAMATAN
Setelah tabung reaksi diinkubasi padsa suhu 37°C selama 24 - 48 jam, maka
didapatkan hasil sebagai berikut:
WAKTU/MENIT
JENIS PENGENCERAN
5 10 15
FENOL 1:80
DISINFEKTAN 1:80
DISINFEKTAN 1:100
DISINFEKTAN 1:150

Koefisien fenol =
 MODUL 7. UJI POTENSI ANTIBIOTIK

A. TUJUAN
Mahasiswa mampu mengevaluasi potensi (aktivitas) antibiotika yang dilihat dari
efek inhibitor tehadap mikroba dengan kondisi yang sesuai.

B. PRINSIP
Membandingkan respon dari mikroba yang peka, dalam kondisi pertumbuhan yang
sama (identik) dari dosis sediaan uji (sampel) terhadap sediaan atau zat baku
(standar) yang telah diketahui konsentrasi dan potensinya. Respon tersebut berupa
zona inhibisi yang terbentuk dari antibiotik terhadap bakteri dengan kondisi yang
sesuai.

C. TEORI DASAR
Aktivitas (potensi) antibiotik dapat dilihat dari efek inhibitor terhadap mikroba
dengan kondisi yang sesuai. Penurunan aktivitas antimikroba kadang- kadang tidak
dapat ditunjukkan dengan metode kimia. Bab ini mencakup cara kerja penetapan
antibiotik yang tercantum dalam Farmakope, yang menggunakan penetapan secara
mikrobiologi sebagai metode analisis standar. Ada dua metode umum yang
digunakan yaitu penetapan cara lempeng-silinder (lempeng) dan turbidimetri
(tabung) seperti tercantum pada tabel berikut:
Penetapan cara lempeng: Penetapan cara dalam silinder yang dipasang tegak lurus
pada lapisan agar padat dalam cawan Petri atau lempeng, sehingga pertumbuhan
mikroba spesifik yang diinokulasikan dihambat pada daerah disekeliling silinder yang
berisi larutan antibiotik berupa lingkaran atau “zona”.

Penetapan cara tabung: Penetapan cara tabung berdasarkan pada penghambatan

pertumbuhan mikroba dalam larutan serba sama, baik dengan antibiotik dan tanpa
antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat.

Unit dan Baku Pembanding: Pada umumnya potensi setiap antibiotik ditunjukkan
dengan satuan unit atau μg aktivitas. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI)
dikalibrasi terhadap baku primer antibiotik yang sesuai. Pengertian g aktivitas berasal
dari sediaan antibiotik yang dipilih sebagai baku pembanding yang dianggap secara
keseluruhan terdiri dari bahan kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi
1000 g/mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode pembuatan dan
pemurnian antibiotik tertentu, aktivitas sediaan dapat lebih dari 1000 g/mg.
Karenanya dapat dimengerti bahwa sediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang
setara dengan jumlah tertentu g baku pembanding asli. Tetapi pada umumnya g
aktivitas adalah tepat setara secara numerik dengan g (bobot) sediaan murni.
Kesulitan timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotik terdiri dari bentuk basa
bebas dan garamnya, dan g aktivitas dinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut;
bahan antibiotik terdiri dari sejumlah komponen yang mempunyai sifat kimia yang
sangat mirip tetapi mempunyai aktivitas antibiotik yang berbeda; atau potensi dari satu
golongan antibiotik dinyatakan dengan baku pembanding yang merupakan salah satu
dari anggota antibiotik, tetapi sediaan itu sendiri dapat tidak serba sama (heterogen).
Dalam hal ini g aktivitas/ unit harus dianggap tidak sama dengan g (bobot) dari
bahan antibiotik.

Mikroba uji : Mikroba uji yang digunakan adalah mikroba uji spesifik dengan nomor
identitas dari American Type Culture Collection (ATCC). Hal ini bertujuan untuk
memastikan mikroba dalam penyimpanan dan pemeliharaan yang benar. Tetapkan
kondisi penyimpanan spesifik selama validasi atau verifikasi metode. Musnahkan
biakan bila terlihat ada perubahan karakteristik mikroba uji. Berikut merupakan contoh
mikroba uji untuk masing-masing antibiotik:
D. ALAT DAN BAHAN
Alat : cawan petri, tabung reaksi, kawat ose, labu takar, jangka sorong, incubator,
pecadang logam, spektofotometer, pH meter
Bahan : Media, antibiotik, pelarut dan suspense bakteri sesuai dengan sample yang
ditentukan.

E. PROSEDUR PERCOBAAN
UJI POTENSI ANTIBIOTIK CARA LEMPENG
1. Beri tanda cawan petri yang akan dipergunakan sesuai pola dengan
menggunakan spidol.
2. Pembuatan Agar inokula 2%
Agar inokula adalah campuran dari nutrien agar dengan suspensi mikroba,
yaitu untuk 100 mL agar ditambahkan 2 mL suspensi mikroba. Pencampuran
ini dilakukan dalam Erlenmeyer, yang kemudian setelah tercampur homogen
dituangkan ke dalam cawan petri yang telah bertanda sebanyak 20 mL. Biarkan
padat.
3. Persiapan kloramfenikol standar
Ditimbang sejumlah tertentu kloramfenikol standar dan dilarutkan dalam
aquadest steril hingga diperoleh larutan induk standar dengan konsentrasi 1000
μg/mL. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan larutan dapar pH 8,0
hingga diperoleh dosis S1 – S5 sesuai dengan antibiotik yang digunakan.
 4. Persiapan Larutan Uji
Larutan uji dibuat dengan konsentrasi dosis sama dengan S3 atau R.
5. Setelah agar inokula padat, letakkan pencadang logam di atas agar tersebut.
Kemudian teteskan larutan standar dan larutan uji sebanyak 0,1 mL pada tiap-
tiap pencadang yang bertanda sama dengan larutan yang akan diteteskan.
6. Pre inkubasi pada suhu kamar, selama 20 – 30 menit. Kemudian inkubasikan
pada suhu 370C, selama 18 – 24 jam. Amati diameter hambatan yang terjadi
dan ukur. Hitung dengan menggunakan perhitungan regresi.

F. HASIL PENGAMATAN
Contoh data dan cara perhitungan uji potensi antibiotik secara mikrobiologi dapat
dilihat pada Farmakope Edisi VI tahun 2020 halaman 1878.

Seri I S1 R S1 R S1 R

Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3

Seri II S2 R S2 R S2 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri III S4 R S4 R S4 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri IV S5 R S5 R S5 R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3
Seri V U R U R U R
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3