ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

22

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental

laboratorium secara in vitro.

4.2 Desain penelitian

Penelitian ini dirancang dengan menggunakan metode randomized post

test controlled group design.

4.3 Lokasi dan waktu penelitian

4.3.1 Loasi penelitian

Pengambilan sampel ekstrak bawang putih dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, sedangkan

perlakuan ekstrak bawang putih (Allium sativum L.) terhadap Aggregatibacter

actinomycetemcomitans dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran Gigi Universitas Airlangga.

4.3.2 Waktu penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan September – Oktober 2012

22

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
23

4.4 Besar sampel

Besarnya sampel optimum yang minimum dan masih dapat digunakan

sebagai jumlah sampel yang valid dalam penelitian ini akan menggunakan

perhitungan rumus Lemeshow:

n=

Keterangan :

n = jumlah sampel tiap kelompok

Z1- = nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan tingkat

kemaknaan (untuk = 0,05 adalah 1,64)

Z1-ß = nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kuasa

(power) sebesar diinginkan (untuk ß=0,10 adalah 1,282)

= standar deviasi kontrol

µ1 = mean kelompok tidak terpapar – (kontrol positif Chlorhexidine gluconate

2%)

µ 2 = mean kelompok terpapar – (ekstrak bawang putih)

Sample size yang akan digunakan sebagai trial adalah 7 kali replikasi.

4.5 Variabel penelitian

Variabel bebas (independent variable) : konsentrasi ekstrak bawang putih

(100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%).

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
24

Variabel terikat (dependant variable) : diameter zona hambat ekstrak bawang

putih terhadap Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Variabel pengendali (control variable) : jumlah bakteri Aggregatibacter

actinomycetemcomitans pada satu media, suhu, pH, temperatur inkubasi kultur

bakteri, temperatur inkubasi uji kepekaan dengan metode difusi, waktu inkubasi

kultur bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans, nutrisi dalam media

Luria-Bertani media (LB-media).

4.6 Definisi operasional

1. Konsentrasi adalah perbandingan antara berat dan volume

(milligram:mililiter).

2. Ekstrak bawang putih (Allium sativum L.) adalah ekstrak yang diperoleh dari

100 gram bawang putih kering yang dilarutkan dengan methanol 60%

kemudian diuapkan dan didapatkan ekstrak bawang putih kental berwarna

coklat kehitaman.

3. Zona hambat ekstrak bawang putih (Allium sativum L.) terhadap pertumbuhan

bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans : bentukan lingkaran jernih di

sekitar sterile paper disc pada agar Luria Bertani biakan bakteri

Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang diukur dengan jangka sorong.

4. Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri yang didapat

dari kultur murni yang kemudian diperbanyak ke dalam petri dish.

5. Kontrol McFarland berisi bakteri yang disuspensi dengan menggunakan

larutan NaCl 0,9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 McFarland

atau sebanding dengan jumlah bakteri 1,5 x108 CFU/ml.

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
25

6. Hasil penelitian berupa skala ratio.

4.7 Instrumen penelitian

4.7.1 Alat penelitian

Alat-alat dibawah ini telah dikalibrasi sehingga memiliki reabilitas dan

validitas yang cukup baik, serta lazim digunakan sebagai instrumen penelitian.

1. Pembakar bunsen

2. Tabung reaksi

3. Ose

4. Pipet ependorf skala maksimum 1 ml dan 0,1 ml

5. Pinset

6. Cawan petri

7. Rak tabung reaksi

8. Termometer

9. Inkubator 37OC

10. Lemari es

11. Alat destilasi

12. Spidol

13. Kertas saring 5 mm steril

14. Jangka sorong

15. Ayakan

16. Kertas Whatman No 1

17. Timbangan analitik

18. Labu ekstraktor

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
26

19. Mesin rotary evaporation

4.7.2. Bahan penelitian

1. Bawang putih (Allium sativum) 1 kg

2. Stok Aggregatibacter actinomycetemcomitans

3. Luria-Bertani media (LB-media)

4. Media BHI

5. Chlorhexidine gluconate 0,2%

6. Air suling steril

4.8. Prosedur penelitian

4.8.1. Pembuatan ekstrak bawang putih (Allium sativum L.)

1. 1kg Bawang putih dikeringkan dan dihaluskan dengan blender kemudian

diayak sehingga didapatkan serbuk 100 gram

2. Serbuk itu lalu diekstraksi dan dihidrolisis dengan 150 ml methanol 60% yang

mengandung 1,2 M HCl.

3. Campuran itu lalu di reflux pada suhu 85 ºC selama 2 jam.

4. Ekstrak tersebut kemudian difilter dengan kertas Whatman No.1

5. Residunya diekstrak ulang dengan pelarut yang sama sampai tidak berwarna

dan di sentrifuge (10 menit, 5000g)

6. Methanol lalu di evaporasi dengan rotary evaporator pada tekanan 50 mmHg

pada suhu 50 ºC.

4.8.2 Pengenceran ekstrak bawang putih (Allium sativum L.)

1. Pada proses pengenceran ekstrak bawang putih ini disediakan 8 buah tabung

reaksi yang diletakkan pada rak tabung reaksi.

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
27

2. Kemudian, diberikan nomor pada masing-masing tabung reaksi tersebut

secara berurutan.

3. Pada tabung reaksi pertama, dituangkan ekstrak bawang putih yang murni

sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 100%.

4. Selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak bawang putih dengan konsentrasi

50% pada tabung yang kedua, maka kita mengambil 1 ml ekstrak bawang

putih pada tabung reaksi yang pertama, kemudian kita melakukan

pencampuran antara ekstrak bawang putih dengan 1 ml aquades pada tabung

kedua, sehingga konsentrasi dari 2 ml ekstrak bawang putih pada tabung

kedua menjadi 50%.

5. Pada tabung yang ketiga ini, kita mengambil 1 ml ekstrak bawang putih dari

tabung kedua, kemudian kita mencampurkannya dengan 1 ml aquades pada

tabung ketiga, sehingga konsentrasi dari 2 ml ekstrak bawang putih pada

tabung ketiga menjadi 25%.

6. Pada tabung berikutnya sampai tabung yang terakhir dilakukan dengan cara

yang sama seperti tabung ketiga, sehingga didapatkan ekstrak bawang putih

dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%.

4.8.3 Pembuatan kultur Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Mengambil satu koloni bakteri dari stok Aggregatibacter

actinomycetemcomitans (disimpan dalam cawan petri dengan media luria-bertani

(LB-media) dengan ose dan mencampurkannya ke dalam tabung reaksi yang telah

berisi media BHI (Brain Heart Infusion). Suspensi dalam tabung tersebut dibuat

mengandung ± 1,5 × 108 sel/ml (蛤 0,5 standar Mc Farland). Setelah itu, bakteri

Aggregatibacter actinomycetemcomitans akan ditanam lagi di dalam plate agar

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
28

Luria-Bertani dengan inkubasi 24 jam, hal ini dilakukan untuk mempertahankan

kualitas bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

4.8.4 Uji difusi ekstrak bawang putih terhadap Aggregatibacter

actinomycetemcomitans

Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang telah ditanam dan

diinkubasi selama 24 jam pada media agar Luria Bertani diinokulasikan lagi ke

dalam BHI. Suspensi dalam tabung tersebut dibuat mengandung ± 1,5 × 108

sel/ml (蛤 0,5 standar Mc Farland). Setelah itu dilakukan swab larutan tersebut

pada agar Luria Bertani dengan menggunakan kapas. Lalu, pada media agar Luria

Bertani diberikan kertas saring yang mengandung ekstrak bawang putih.

Untuk uji difusi, setiap cawan petri media biakan Aggregatibacter

actinomycetemcomitans dibagi menjadi 4 daerah. Uji ini akan disertai 1 cawan

petri untuk kontrol positif dan 1 cawan untuk kontrol negatif.

Kontrol positif dengan chlorhexidine gluconate 0,2% dilakukan dengan

cara menjepit kertas saring 5 mm (daya serap kurang lebih 0,025 ml) lalu

dicelupkan ke dalam larutan Chlorhexidine gluconate 0,2%. Setelah itu akan

diletakkan di tengah koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Pemberian ekstrak bawang putih dilakukan dengan cara menjepit kertas

saring 5 mm dengan pinset lalu dicelupkan ke dalam ekstrak bawang putih dengan

konsentrasi 100%. Lalu kertas saring tersebut akan diletakkan salah satu dari

daerah koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang sudah dibagi

menjadi 4 bagian (Gambar 4.1). Pemberian ekstrak bawang putih dengan

konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78% sama dengan

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
29

pemberian sebelumnya. Setiap cawan petri yang telah diberi perlakuan akan

dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37ºC selama 3x24 jam.

1 2

3 4

Gambar 4.1. Skema pemberian kertas saring pada cawan petri. Daerah 1, 2, 3, 4 masing-
masing akan diberikan ekstrak bawang putih dengan konsentrasi berbeda

Dengan demikian akan didapatkan diameter zona hambat kontrol dan tiap

konsentrasi. Pengujian ini dilakukan trial dengan 7 kali replikasi awal, untuk

menentukan sample size.

4.8.5 Cara menghitung diameter zona hambat

Cara mengukur dengan cara membalik cawan petri, dengan dasar

menghadap ke atas dan tutup cawan petri tidak diangkat sehingga zona hambat

terlihat transparan. Diameter yang diukur adalah diameter luar, yaitu diameter

yang dihitung dari titik terluar zona hambat sampai pusat lingkaran. Dilakukan 2

kali pengukuran dan diambil rata-ratanya. Pertama-tama, peneliti menentukan

jarak terpanjang dari lingkaran zona hambat yang terbentuk. Lalu di masing-

masing sisi ditandai dengan spidol dan ditarik garis lurus sehingga membentuk

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
30

garis diameter. Diameter tersebut dihitung dengan menggunakan jangka sorong

dengan ketelitian 0,05 mm. Pengukuran diameter zona hambat dilakukan setelah

inkubasi selama 3x24 jam.

4.9 Alur Penelitian

4.9.1 Persiapan ekstrak bawang putih

1 kg bawang putih
Diayak

Dikeringkan dan diblender

100g serbuk kering bawang putih

150 ml methanol 60%

Ekstraksi dan hidrolisis yang mengandung 1,2
M HCl.

Reflux pada suhu 85ºC

selama 2 jam

Filter dengan kertas

Whatman No. 1

Residu diekstrak ulang

sampai tidak berwarna dan
di sentrifuge

Evaporasi

Ekstrak bawang putih

(Allium sativum L.) 100%

Pengenceran 7x

Ekstrak bawang putih dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%,

12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
31

4.9.2 Persiapan kultur Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Stok Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Media BHI
(± 1,5 × 108 sel/ml
蛤0,5 standar Mc Farland)

Plate agar Luria-Bertani

inkubasi 24 jam

Kultur Aggregatibacter actinomycetemcomitans

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
32

4.9.3 Uji difusi ekstrak bawang putih terhadap Aggregatibacter

actinomycetemcomitans

Kultur murni bakteri Aggregatibacter

actinomycetemcomitans

Bakteri diinokulasi dalam larutan BHI

Pembentukan konsentrasi bakteri sesuai

standar Mc Farland 0,5

Swab larutan bakteri

pada agar Luria Bertani

Meletakkan kertas saring yang mengandung

ekstrak bawang putih pada agar Luria Bertani

Konse Konse Konse Konse Konse Konse Konse Konse Kontrol

ntrasi ntrasi ntrasi ntrasi ntrasi ntrasi ntrasi ntrasi positif
100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,12% 1,56% 0,78% dan
negatif

Inkubasi selama
3x24 jam

Pengukuran zona hambat

dengan jangka sorong

Analisis data

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI

 ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
33

4.10. Analisa data

Penganalisaan data dari hasil pengukuran diameter zona hambat

pertumbuhan Aggregatibacter actinomycetemcomitans (mm) oleh ekstrak bawang

putih yang dibandingkan terhadap kontrol positif oleh Chlorhexidine gluconate

0,2% dari penelitian ini akan diukur dengan one-way anova.

SKRIPSI DAYA HAMBAT EKSTRAK BAWANG ... PAMELA DJAUHARI