Nama MHS : Silvi Nur Azalia Amanda Dosen : apt.

Hardi Astuti Witasari,

M.Sc
NIM/Kelas : 1900023046/ 6A Asisten
Gol/Kel : 2/5 Nilai Laporan
Hari/Tgl prak : 2 Juli 2022

LAPORAN PRAKTIKUM

PENGEMBANGAN OBAT TRADISIONAL

PERCOBAAN VI

ANALISIS OBAT TRADISIONAL SECARA MIKROBIOLOGI

LABORATORIUM PENGEMBANGAN OBAT TRADISIONAL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS AHMAD DAHLAN

YOGYAKARTA

2022
 PERCOBAAN VI
ANALISIS OBAT TRADISIONAL SECARA MIKROBIOLOGI

A. Tujuan
Pada mahasiswa diharapkan mampu melakukan analisis mutu produk jadi obat
tradisional, obat herbal terstandar dan fitofarmaka secara mikrobiologi yang meliputi
identifikasi adanya bakteri patogen (E. coli) dan besarnya kandungan mikroba (angka lempeng
total).
B. Dasar Teori
Keamanan produk terutama pada makanan, minuman, kosmetik, sediaan
obatatau obat tradisional (jamu) merupakan suatu tuntutan yang telah dikemukakan
sejakmunculnya gangguan kesehatan manusia akibat adanya cemaran mikroorganisme.
Produk yang tercemar mikroorganisme tersebut dapat memproduksi racun yang dapat
menyebabkan timbulnya suatu penyakit.
Dalam bentuk bahan dan produk kefarmasian baru, yaitu ekstrak, maka selain
persyaratan monografi bahan baku (simplisia), juga diperlukan persyaratan parameter
standar umum dan spesifik. Salah satu parameter non spesifik ekstrak adalah parameter
cemaran mikroba dan angka lempeng total (ALT) serta cemaran kapang, khamir dan
aflatoksin. Parameter ini bertujuan memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak boleh
mengandung mikroba patogen dan tidak mengandung mikroba nonpatogen melebihi
batas yang ditetapkan karena berpengaruh pada stabilitas ekstrak dan berbahaya
(toksik) bagi kesehatan.
Obat tradisional adalah obat yang seringkali dikonsumsi oleh masyarakat
karena, murah, dan dipercaya secara turun-temurun sebagai alternatif menyembuhkan
berbagai penyakit. Peraturan Menteri Nomor 661/Menkes/SK/VII/2008 tentang
persyaratan obat tradisional menyatakan bahwa obat tradisional harus bebas dari
mikroba patogen, salah satunya adalah Escherichia coli. Escherichia coli adalah bakteri
flora normal pada usus manusia. Escherichia coli dapat bersifat patogen apabila hidup
diluar usus manusia. Deteksi cemaran mikroba terhadap obat tradisional (OT) adalah
cara yang dilakukan untuk mendeteksi keberadaan mikroba yang bersifat patogen pada
manusia. Bakteri patogen yang biasanya terdapat pada obat tradisional salah satunya
adalah Escherichia coli.
Pemeriksaan adanya mikroba juga dapat dilakukan menggunakan metode
Angka Lempeng Total (ALT). Metode Angka Lempeng Total (ALT) merupakan
metode kuantitatif untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel.
Menurut Rizal (2006) metode ALT merupakan metode perhitungan jumlah koloni
mikroba aerob mesofilik. Metode ALT dapat digunakan dengan cara tuang, cara tetes,
dan cara sebar. etode yang digunakan untuk menghitung angka lempeng total di dalam
bahan minuman adalah metode angka lempeng (standard plate count). Standard plate
count (SPC) dipergunakan untuk menentukan kerapatan bakteri aerob dan anaerob
fakultatif heterotrop dalam air. Penentuan dengan cara ini merupakan pengukuran
empiris saja, oleh karena tiap spesies bakteri membentuk koloni tersendiri dalam
pertumbuhannya. Dalam metode ini diperlukan pengenceran sebelum ditumbuhkan
pada media sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam
jumlah yang dapat dihitung dengan mata. Larutan yang digunakan untuk pengenceran
dapat berupa larutan buffer, larutan garam fisiologis 0,9% atau larutan ringer (Alaerts,
dan Sumestri, 1984).
Prinsip metode SPC adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan
pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung (Fardiaz, 1992). Untuk menghitung angka lempeng
total dengan metode SPC digunakan buffered peptone water (BPW) sebagai pengencer,
dan plate count agar (PCA) sebagai media pertumbuhan.
Adapun cara menghitung angka lempeng total yaitu menggunakan rumus sebagai
berikut:
𝐉𝐮𝐦𝐥𝐚𝐡 𝐤𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢
ALT = 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞 𝐲𝐚𝐧𝐠 𝐝𝐢𝐭𝐚𝐧𝐚𝐦 X faktor pengencaran

Satuan ALT = CFU/ml atau CFU/g

Alat dan Bahan yang perlu digunakan

Alat Bahan
1. Lampu spiritus 1. Sampel
2. Autoclave 2. Nacl fisiologis steril
3. Incubator 3. Media PCA
4. Mikropipet 4. Media TBX
5. Spreader
C. Alat dan Bahan
1. Bahan
Serbuk simplisia, ekstrak, produk, PCA, NaCl 0,9% steril
2. Alat
Spiritus, cawan petri, pipet ukur, tabung reaksi (iwaki pyrex), beaker glass \(iwaki
pyrex) rak tabung reaksi, mikropipet (biohit proline), yellow tip (gilson), blue tip
(gilson), spreader, inkubator (heraus) dengan suhu 37°C, oven, autoklaf.

D. Cara Kerja
1. Identifikai Penentuan Jumlah E. coli pada sampel
Ambil 100𝜇𝐿 sampel pada pengenceran tertentu

Inokulasi pada media TBX, ratakan

Inkubasi 18-24 jam dengan suhu 37°C

Amati koloni yang tumbuh

Warna biru-kehijauan
(Positif E.coli)

2. Uji Angka Lempeng Total (ALT)

1. Pengenceran Sampel (sample berupa cairan dipipet volumenya, padat
ditimbang) Sampel diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis. Pengenceran
dilakukan 10 kali, 100 kali, 1000 kali dan 10.000 kali. Adapun cara
pengencerannya adalah sebagai berikut :
10 kali : Sampel dipipet secara aseptic sebanyak 0,5 ml (sampel cair ) /
sampel ditimbang 0,5 g untuk sampel padat ke dalam tabung
reaksi yang telah berisi 4,5 ml larutan NaCl fisiologis, kemudian
 dihomogenkan.
100 kali : Diambil 0,5 ml dari pengenceran 10 kali, ditambahkan 4,5 ml
larutan NaCl fisiologis dan dihomogenkan.
1000 kali : Diambil 0,5 ml dari pengenceran 100 kali, ditambahkan 4,5 ml
larutan NaCl fisiologis dan dihomogenkan.
10.000 kali : Diambil 0,5 ml dari pengenceran 1000 kali, ditambahkan 4,5
ml larutan NaCl fisiologis dan dihomogenkan
Sample yang berupa sediaan padat dibuat menjadi bentuk serbuk dulu, dicampur
homogen, kemudian ditimbang seksama sebanyak 0,5 g. Dimasukkan secara
aseptic ke dalam tabung yang telah berisi 4,5 ml larutan NaCl fisiologis steril
(pengenceran 10 kali) pengenceran selanjutnya sama dengan diatas.

2. Pemeriksaan Mikrobiologi
a. Perhitungan angka lempeng total
Sebanyak 50𝜇𝐿 sampel dari pengenceran 10-10.000

Masing-masing di inokulasi pada media Mueller Hinton (MH)

Ratakan dengan spreader steril

Diamkan larutan sampai meresap

Inkubasi pada suhu 35°C – 37°C selama 24 jam (posisi petri terbalik)

Hitung koloni yang tumbuh

Pembacaan 30-300 koloni

Interpretasi Hasil Uji Angka Lempeng Total
1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30
– 300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap gram
contoh.
2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni atau lebih 300 koloni,
dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya.
Hasil sebagai angka lempeng total dalam tiap gram contoh.
3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan
jumlah koloni antara 30 – 300, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat
pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil
perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar
dari dua kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di bawahnya, maka angka
lempeng total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (misal pada
pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni
rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140 10-2). Bila hasil perhitungan pada tingkat
pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari dua kali jumlah
koloni rata-rata pada pengenceran di bawahnya, maka angka lempeng total dihitung
dari rata-rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut (misal pada
pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-rata 293, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni
56789:;
rata-rata 41, maka angka lempeng total adalah 5
X 10-2 = 351,2 10-2 ).

4. Bila tidak ada satupun koloni dalam cawan maka angka lempeng total dinyatakan
sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
5. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan dari
tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa sektor (2, 4 atau 8)
dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor. Angka lempeng total adalah jumlah koloni
dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan
dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan
dikalikan dengan faktor pengenceran.
6. Jika jumlah koloni rata-rata dari 1>8 bagian cawan lebih dari 200, maka angka lempeng
total dinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan faktor pengenceran.
7. Perhitungan dan pencatatan hasil angka lempeng total hanya ditulis dalam dua angka.
Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari lima dan dibulatkan ke atas
 bila lebih dari lima. Sebagai contoh 523 x 10-3 dibulatkan menjadi 52 x 10-4 . Untuk
83,6 x 10-3 dibulatkan 84 x 10-3 .
8. Jika dijumpai koloni spreader meliputi 1>4 sampai 1>2 bagian cawan, maka dihitung
koloni di luar daerah spreader, dengan keadaan seperti di atas maka dicatat sebagai
“Spr“. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya
(pengujian diulang).
9. Jika dijumpai koloni spreader tipe rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah
dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok spreader terdiri dari beberapa
rantai, maka tiap rantai dihitung sebagai satu koloni.

E. Pembahasan
Pada praktikum kali ini yaitu mengenai analisis obat tradisional secara
mikrobiologi yang bertujuan agar mahasiswa mampu melakukan analisis mutu produk
jadi obat tradisional, obat herbal terstandar dan fitofarmaka secara mikrobiologi yang
meliputi identifikasi adanya bakteri patogen (E. Coli) dan besarnya kandungan mikroba
(angka lempeng total) (ALT).
Sebelum memulai praktikum, kami mempersiapkan semua alat dan bahan yang
akan digunakan dalam praktikum ini. Sebelum penanaman sampel ke media agar,
sampel diambil dan di encerkan terlebih dahulu dalam larutan NaCI fisiologis dan
kemudian bisa melakukan tahapan penanaman sampel pada media agar yang sudah
disediakan. Terdapat 5 media agar yang sudah disediaakan, yaitu untuk pengenceran
10x, 100x, 1000x, 10.000x dan TBX. TBX ini untuk mengetahui ada atau tidaknya
bakteri E.coli yang hasil positifnya ditandai dengan menunjukkan hasil berwarna biru
kehijauan pada sampel setelah diinkubasi selama 18-24 jam.
Hasil data kelompok kami menunjukkan semua media agar ditumbuhi oleh
bakteri. Semakin tinggi konsentrasi maka semakin sediki pula jumlah bakteri yang
tumbuh. Ini karena semakin tinggi konsentrasi maka semakin encer pula larutannya.
Setelah menghitung tiap koloni pada masing – masing cawan petri, didapatkan hasil
jumlah koloni secara beruturan :
- Pengenceran 10x = 27
- Pengenceran 100x = 29
- Pengenceran 1000x = 1
- Pengenceran 10.000x = 36
 - TBX = 154
Untuk perhitungan angka lempeng total, dipilih cawan petri dari satu
pengencerannya yang menunjukkan jumlah koloni antara 30 – 300. Sehingga jumlah
koloni yang masuk range tersebut yaitu pada cawan petri pada pengenceran 10.000
yaitu 36 koloni dan TBX yaitu 154 koloni. Sehingga perhitungan ALT nya adalah
sebagai berikut :

𝐉𝐮𝐦𝐥𝐚𝐡 𝐤𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢
ALT = 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐞 𝐲𝐚𝐧𝐠 𝐝𝐢𝐭𝐚𝐧𝐚𝐦 X faktor pengencaran

1. Pengenceran 10.000
7A
ALT = ;,: CD X 10.000

ALT = 3.600.000 CFU/ml

2. TBX
:E9
ALT = ;,: CD X 100

ALT = 154.000 CFU/ml

F. Kesimpulan

Dari data hasil praktikum dan penjelasan diatas, dapat disimpulkan bahwa :

1. Didapatkan jumlah koloni sebagai berikut : 548 (10x), 465 (100x), 439 (1000x), 200
(10.000)
2. Untuk media agar TBX didapatkan hasil jumlah koloni sebesar 434 koloni dan tidak
menunjukkan adanya bakteri E.coli karena tidak ada perubahan menjadi warna biru
kehijauan
3. Didapatkan hasil perhitungan ALT sebesar 20.000.000 CFU/ml

G. Daftar Pustaka

Anonim, 2017. Farmakope Herbal Indonesia Edisi 2. Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia

Tim Dosen Pengembangan Obat Tradisional, 2022. PETUNJUK PRAKTIKUM

PENGEMBANGAN OBAT TRADISIONAL. Fakultas Farmasi. Universitas Ahmad
Dahlan. Yogyakarta.
Lampiran