BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis dan Desain Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimen dengan

desain penelitian menentukan daya hambat bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL

terhadap pertumbuhan P.aeruginosa pada Media Mueller Hinton.

3.2 Populasi dan Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah BAL Lactobacillus

sp yang berada di Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor.

Sampel yang digunakan adalah isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus,

dan L.casei yang diperoleh dari Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian

Bogor.

Bakteri uji yang digunakan adalah isolat murni P.aeruginosa yang

diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Sekolah Farmasi Institut

Teknologi Bandung.

3.3 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Politeknik Kesehatan

Kementerian Kesehatan Bandung Jurusan Analis Kesehatan pada bulan Mei

sampai dengan bulan Juni 2014.

16
 17

3.4 Rencana Pengumpulan Data

Data dalam penelitian ini merupakan data primer. Data primer tersebut

diperoleh dari hasil pengamatan daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan

P.aeruginosa melalui pemeriksaan laboratorium yaitu dengan melakukan uji

aktivitas antibakteri bakteriosin baik secara tunggal (tahap 1) maupun kombinasi

dari ketiga Sampel Lactobacillus (tahap 2). Pertimbangan kombinasi tersebut

berdasarkan spektrum hambatan bakteriosin yang terbesar yang diperoleh dari

hasil penelitian tahap 1. Pengujian daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan

P.aeruginosa masing-masing dilakukan sebanyak 3 kali (triplo). Selanjutnya data

yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel.

Penelitian ini menggunakan dua metode yaitu metode difusi sumur (hole

methode) dan metode mikrodilusi.

3.4.1 Alat dan Bahan

3.4.1.1 Alat

Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :

- Cawan petri

- Tabung reaksi

- Ose

- Spirtus

- Objek glass

- Erlenmeyer 250 mL

- Gelas kimia 500 mL

 18

- Gelas ukur 100 mL

- Pipet ukur 10 mL

- Mikropipet

- Tip biru

- Tip kuning

- Milipore ø 0,22 μm

- Corong kecil

- Tabung ependorf

- Inkubator

- Oven

- Autoclave

- Neraca teknis

- Jangka sorong

- Ultra centrifuge

3.4.1.2 Bahan

Adapun bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah :

- Isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei.

- Isolat murni P.aeruginosa

- Media Mac Conkey agar

- Media Mueller Hinton agar dan Mueller Hinton broth

- NaCl fisiologis steril

- Aquades steril
 19

- Media MRS agar miring dan MRS broth

- Media uji biokimia gula-gula panjang (Glukosa, Laktosa, Manitol,

Maltosa, Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat, dan Semi

solid)

- Larutan BaCl2 1%

- Larutan H2SO4 1%

- Reagen zat pewarnaan Gram

3.4.2 Cara Kerja

3.4.2.1 Persiapan Penelitian

1) Sterilisasi Alat

Dicuci bersih semua alat-alat gelas yang digunakan dalam

penelitian, kemudian dikeringkan lalu dibungkus dengan kertas coklat

dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 180o C selama 1 jam atau

pada suhu 160o C selama 2 jam.

2) Pembuatan Media Mueller Hinton Agar

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) agar adalah dengan cara

dilarutkan 38 gram bubuk MH agar dengan 1 liter aquades ke dalam

labu erlemneyer, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH

disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121o C.

kemudian diangkat dan tunggu sampai suhu media ± 40 o C lalu

dituangkan ke dalam cawan petri dengan jumlah tuangan ± 20 mL

pada setiap cawan petri secara aseptik.

 20

3) Pembuatan Media Mueller Hinton Broth

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) broth adalah dengan cara

dilarutkan 38 gram bubuk MH broth dengan 1 liter aquades ke dalam

gelas kimia, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH broth

kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi masing-masing

sebanyak 10 mL kemudian ditutup dengan kapas kassa lalu dibungkus

dengan kertas coklat. Media MH broth disterilkan dalam autoclave

selama 15 menit pada suhu 121o C kemudian diangkat.

4) Pembuatan Standar Mc Farland 0,5

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering dan steril, kemudian

diisi larutan asam sulfat (H2SO4) 1% sebanyak 9,95 mL dan Larutan

barium klorida (BaCl2) 1% sebanyak 0,05 mL kemudian dikocok.

Endapan barium sulfat (BaSO4) yang terbentuk dalam tabung setara

dengan jumlah bakteri 1,5 x 108 CFU/mL.

5) Pembuatan Bakteriosin

Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei masing-masing

ditanam pada MRS broth, kemudian diinkubasi pada suhu 35o C

selama 48 jam. Kemudian suspensi tersebut disentrifugasi 8000 rpm

selama 30 menit pada suhu 4o C, kemudian supernatan yang terbentuk

disaring dengan milipore filter ø 0,22 μm dan filtrat yang didapatkan

merupakan bakteriosin.
 21

6) Pembuatan Suspensi P.aeruginosa

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering, dan steril kemudian

dimasukkan NaCl fisiologis masing-masing sebanyak 10 mL. Diambil

menggunakan ose beberapa koloni bakteri dari biakan murni

P.aeruginosa kemudian dicampur dalam tabung reaksi sampai

homogen, lalu dibandingkan kekeruhan yang terjadi dengan standar

Mc Farland 0,5.

3.4.2.2 Prosedur Penelitian

1) Uji Penegasan

Isolat murni P.aeruginosa di isolasi pada media Mac Conkey agar,

diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh

diambil dengan ose lalu ditanam pada uji biokimia (Glukosa, Laktosa,

Manitol, Maltosa, Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat,

dan Semi solid) diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam kemudian

hasil penanaman diamati, dan dicocokkan dengan tabel. Isolat murni

P.aeruginosa dibuat pulasan kemudian diwarnai dengan pewarnaan

Gram Setelah diwarnai, masing-masing preparat tersebut diamati

dibawah mikroskop dengan lensa objektif 100x menggunakan minyak

imersi.
 22

2) Uji Penelitian

Metode : Difusi Sumur

- Disiapkan alat dan bahan yang deperlukan.

- Dibuat sampel bakteriosin.

- Dengan menggunakan lidi kapas steril dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa yang setara dengan standar Mc Farland 0,5 pada

permukaan media MH agar secara merata dan aseptik.

- Dibuat lubang atau sumur dengan menggunakan tabung kecil steril

(ø ± 1 cm) pada MH agar yang telah dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa.

- Dipipet sampel bakteriosin dengan menggunakan mikropipet

sebanyak 50 μL kemudian dimasukkan ke dalam sumur.

- Dilakukan pengujian sebanyak 3 kali (triplo) pada setiap jenis

sampel yang sama.

- Dibuat kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-).

- Diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam dalam inkubator.

- Diamati ada tidaknya zona hambat yang terbentuk terhadap

pertumbuhan P.aeruginosa di sekitar sumur.

- Zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong dan

dicatat diameter zona hambat yang terbentuk.

Metode : Mikrodilusi

- Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan

 23

- Dipipet suspensi P.aeruginosa sebanyak 5 μL menggunakan

mikropipet ditambahkan ke dalam 10 mL Nutrien Broth lalu

dihomogenkan.

- Disiapkan 12 tabung reaksi yang bersih, kering, dan steril. Dipipet

sebanyak 100 μL MH broth kemudian dimasukkan pada tabung 1

sebagai kontrol negatif (-).

- Pada tabung 2-12 dimasukkan sebanyak 100 μL suspensi bakteri

P.aeruginosa.

- Tabung 3 ditambahkan 100 μL sampel bakteriosin kemudian

dihomogenkan.

- Dari tabung 3 diambil 100 μL kemudian dipindahkan ke tabung 4

(pengenceran sampel bakteriosin). Pengenceran dilakukan sampai

tabung ke 12 yang memiliki konsentrasi terkecil.

- Tabung diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam, kemudian hasil

dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan adalah

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM).

- Sebanyak 5 μL setiap bagian jernih dipindahkan pada MH agar,

diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam, kemudian hasil dibaca.

Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan adalah

Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM).

 24

Isolat murni P.aeruginosa

Langsung Tidak Langsung

pewarnaan Gram Ditanam pada media MC agar

Uji Biokimia

Gula-gula Panjang

Glukosa Laktosa Manitol Maltosa Sukrosa Urea TSIA Indol MR VP SC SS

Gambar 3.1 Skema Uji Penegasan P.aeruginosa

 25

Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei

10 mL MRS broth

Di inkubasi suhu 35o C selama 48 jam

Sentrifugasi 8000 rpm, selama 30 menit pada suhu 4o C

Supernatan disaring dengan milipore 0,22 μm

Ekstrak kasar bakteriosin

Gambar 3.2 Skema Pembuatan Bakteriosin

 26

Mc Farland 0,5 suspensi P.aeruginosa

MH Agar

3 sampel Bakteriosin
@ 50 μL diuji
Sebanyak 3 kali (triplo)

Diinkubasi suhu 37o C selama 48 jam

diamati ada tidaknya zona hambat dan diukur diameternya

Gambar 3.3 Skema Kerja Uji Penelitian P.aeruginosa metode difusi

 27

5 μL suspensi
P.aeruginosa ≈ Mc Farland 0,5 10 mL Nutrien broth
Tabung 2-12 dimasukkan
Tabung 3 100 μL suspensi bakteri uji
+100μL

Bakteriosin dibuang
100μL100μL 100μL100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
K- K+ ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

100 μL MH broth

Diinkubasi suhu 37o C selama 48 jam

Hasil dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan(KHM).

5 μL dari setiap bagian jernih ditanam pada MH agar

Diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam

Hasil dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan koloni (KBM).

Gambar 3.4 Skema Kerja Uji Penelitian P.aeruginosa metode mikrodilusi

 28

3.5 Rencana Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian, ditampilkan dalam bentuk tabel

kemudian dilihat daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan P.aeruginosa

pada media Mueller Hinton yang dilakukan sebanyak 3 kali (triplo).

Tabel 3.1 Hasil Pengamatan Daya Hambat Bakteriosin terhadap Pertumbuhan

P.aeruginosa Metode Difusi

Jenis Diameter Zona Hambat (mm)

No. Volume
Bakteriosin 1 2 3 Rata-rata
1. L.bulgaricus 50 μL
2. L.acidophilus 50 μL
3. L.casei 50 μL

Tabel 3.2 Hasil Pengamatan Daya Hambat Bakteriosin terhadap Pertumbuhan

P.aeruginosa Metode Dilusi

Pengenceran
Jenis
No. Pengujian K 1/1 1/12
Bakteriosin K+ 1/2 1/4 1/32 1/64 1/256 1/512 1/1024
- 6 8

1
1. L.bulgaricus 2
3
1
2. L.acidophilus 2
3
1
3 L.casei 2
3
 29

3.6 Rencana Jadwal Penelitian

Rencana jadwal untuk penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai

berikut :

Tabel 3.3 Rencana Jadwal Penelitian

N De
Kegiatan Jan Feb Mar Apr Mei Juni Juli
o s
1. Studi pustaka
2. Bimbingan
Penyusunan
3.
proposal
4. Seminar penelitian

5. Persiapan penelitian

6. Persiapan sampel
7. Pemeriksaan lab
8. Pengumpulan data
9. Analisis data
10
Penyusunan KTI
.
11
Sidang KTI
.

3.7 Rencana Biaya Penelitian

Rencana biaya untuk penelitian yang akan dilakukan ini terdiri dari :

1. Penyusunan proposal Rp 150.000,-

2. Biaya penelitian Rp 800.000,-

3. Pembuatan KTI Rp 250.000,-

4. Akomodasi Rp 100.000,- +

Total Rp 1.300.000,-
30