BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Penelitian mengenai uji aktivitas bakteriosin dari Lactobacillus sp dalam

menghambat pertumbuhan P.aeruginosa yang dilakukan pada bulan Mei sampai

dengan Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Analis Kesehatan

Poltekkes Kemenkes Bandung. Penelitian dimulai dengan melakukan uji

penegasan pada bakteri sampel dan bakteri uji kemudian dilakukan uji penelitian

aktivitas bakteriosin Lactobacillus sp terhadap P.aeruginosa dengan

menggunakan metode difusi agar dan metode mikrodilusi.

4.1.1 Uji Penegasan

Sebelum dilakukan uji penelitian aktivitas bakteriosin terlebih dahulu

dilakukan uji penegasan pada bakteri sampel dan bakteri uji yaitu dengan

pemeriksaan mikroskopis dengan pewarnaan Gram dan uji biokimia, uji

penegasan dilakukan untuk memastikan spesies bakteri yang digunakan. Pada

penelitian ini menggunakan tiga jenis BAL sebagai bakteri sampel yaitu

Lactobacillus acidhopilus, Lactobacillus bulgaricus, dan Lactobacillus casei dan

untuk bakteri uji menggunakan P.aeruginosa.

30
 31

4.1.1.1 Uji Penegasan Bakteri Uji

Hari pertama :

1. Hasil pemeriksaan secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram

bentuk : batang

sifat : Gram negatif

susunan : menyebar

2. Isolasi

Biakan P.aeruginosa kemudian ditanam pada media MC agar

Hari kedua :

Hasil isolasi pada media MC

bentuk koloni : bulat

ukuran koloni : ø 2-3 mm

warna koloni : jernih

sifat : non laktosa fermenter, halus, licin

elevasi : cembung

Koloni P.aeruginosa kemudian ditaman pada media uji biokimia

Hari ketiga :

Hasil uji biokimia P.aeruginosa sebagai berikut

 32

Tabel 4.1 Hasil Uji Biokimia Bakteri Uji

Media Uji Biokimia Hasil
Glukosa (+)
Laktosa (-)
Manitol (-)
Maltosa (-)
Sukrosa (-)
Indol (-)
TSIA M/K H2S -
Urea (-)
MR (-)
VP (-)
SC (+)
SS Gerak (+)
Keterangan : (+) : Hasil positif
(-) : Hasil negatif
M/K : Merah/Kuning (hasil fermentasi gula)

Hasil uji penegasan yang dilakukan menunjukkan bahwa spesies bakteri

uji adalah P.aeruginosa.

4.1.1.2 Uji Penegasan Bakteri Sampel

Uji penegasan yang dilakukan pada bakteri sampel meliputi pemeriksaan

morfologi bakteri serta pengujian biokimia. Pemeriksaan morfologi dilakukan

secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram sedangkan pengujian biokimia

menggunakan media uji.

 33

Tabel 4.2 Hasil Pemeriksaan Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Sampel

Parameter L.acidophilus L.bulgaricus L.casei

Morfologi bakteri
Bentuk batang batang Batang
Sifat Gram positif Gram positif Gram positif
susunan berantai berantai bergerombol
Uji biokimia
Glukosa (-) (+) (-)
Laktosa (+) (+) (+)
Sukrosa (+) (+) (+)
Maltosa (+)/g (+) (+)
Manitol (-) (-) (+)
Indol (-) (-) (-)
Semi solid (-) (-) (-)
Simon sitrat (-) (-) (-)
TSIA K/K H2S (-) K/K H2S (-) K/K H2S (-)
Uji Oksidase (-) (-) (-)
Keterangan : (+) : Hasil positif
(-) : Hasil negatif
(+)/g : Hasil positif dan dihasilkan gas
K/K : Kuning/Kuning (hasil fermentasi gula)

Hasil uji penegasan yang dilakukan menunjukkan bahwa spesies bakteri

sampel adalah Lactobacillus acidhopilus, Lactobacillus bulgaricus, dan

Lactobacillus casei.

4.1.2 Persiapan Pembuatan Supernatan bakteriosin Lactobacillus sp

Untuk pembuatan supernatan bakteriosin masing-masing isolat bakteri

sampel dibuat suspensi dengan kekeruhan setara 0,5 Mc Farland (1,5 x 108

CFU/mL) kemudian sebanyak 500 μL suspensi tersebut ditanam dalam 10 mL

 34

MRS Broth diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC. Hasil biakan bakteri

sampel tersebut diolah untuk memisahkan metabolit dengan sel-sel bakteri

produsennya. Pengolahan bakteri sampel dilakukan dengan cara sentrifugasi 8000

rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan tersebut lalu disaring

menggunakan millipore ø 0,22 μm sehingga didapatkan supernatan yang bebas sel

selanjutnya supernatan tersebut merupakan supernatan bakteriosin.

4.1.3 Uji Penelitian

Supernatan bakteriosin kemudian diuji karakterisasi untuk

mengetahui sifat metabolit yang terkandung dalam sampel uji. Parameter yang

diuji meliputi pengujian ketahanan terhadap pH dengan menambahkan asam atau

basa pada supernatan bakteriosin lalu diukur sampai didapatkan pH yang sesuai

kemudian diuji aktivitas penghambatannya pada bakteri kontrol yang sensitif

terhadap metabolit yaitu Enterococcus faecalis. Hasil penelitian dapat dilihat pada

tabel berikut.

Tabel 4.3 Hasil Uji Ketahanan Bakteriosin terhadap pH

pH
Sampel Uji
K 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
L.acidophilus (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-)
L.bulgaricus (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-)
L.casei (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-)
Keterangan : (+) = hasil positif, menunjukkan penghambatan terhadap bakteri
kontrol
K = kontrol, supernatan bakteriosin tanpa perlakuan
 35

Supernatan bakteriosin Lactobacillus sp kemudian diuji aktivitas daya

hambatnya terhadap P.aeruginosa dengan dua metode yaitu metode difusi agar

menggunakan media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan tiga kali pengulangan.

Daya hambat ditandai dengan terbentuknya daerah bening (zona hambat) di

sekitar sumur yang telah diisi dengan bakteriosin. Hasil penelitian dapat dilihat

pada tabel berikut.

Tabel 4.4 Hasil Uji Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus sp terhadap P.aeruginosa

Sampel Uji Volume Diameter Zona Hambat (mm)
L.acidophilus 50 μL 11,4 ± 0,64
L.bulgaricus 50 μL 11,4 ± 0,62
L.casei 50 μL 9,5 ± 0,28
Ciprofloksasin (K+) 50 μL 21,05 ± 0,21
NaCl fisiologis (K-) 50 μL 5±0
Aquadest steril (K-) 50 μL 5±0
MRS Broth (K-) 50 μL 5±0
Keterangan : diameter sumur = 5mm

Pengujian aktivitas daya hambat dengan metode mikrodilusi

menggunakan media Mueller Hinton Broth (MHB) dengan tiga kali pengulangan.

Daya hambat ditandai dengan tidak terjadi pertumbuhan bakteri (jernih) pada

konsentrasi terkecil yang merupakan nilai KHM kemudian 1 ose setiap bagian

jernih ditanam pada MHA konsentrasi terkecil yang tidak terjadi pertumbuhan

koloni bakteri adalah nilai KBM. Hasil penelitian dapat dilihat pada tabel berikut.
 36

Tabel 4.5 Nilai KHM dan KBM Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus sp terhadap
P.aeruginosa
Sampel Uji KHM (%) KBM (%)

L.acidophilus 6,25 12,5

L.bulgaricus 6,25 12,5

L.casei 6,25 25,0

Ciprofloksasin 0,1 x 10-4 0,1 x 10-4

Keterangan : Ciprofloksasin konsentrasi 100 μg/mL

Nilai KHM dan KBM antibiotik dinyatakan dalam gr/100mL
(1x10-4 μg/mL)

Selanjutnya supernatan bakteriosin dikontakkan dengan berbagai derajat

pH untuk mengkonfirmasi metabolit yang berperan dalam penghambatan terhadap

bakteri uji. Hasil penelitian dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 4.6 Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus sp Setelah Kontak dengan Berbagai

Derajat pH terhadap Pertumbuhan P.aeruginosa
pH
Sampel Uji
K 3 4 5 6 7 8 9 10 11
L.acidophilus (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-)
L.bulgaricus (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-)
L.casei (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
Keterangan : (+) = hasil positif, menunjukkan penghambatan terhadap bakteri
kontrol
K = kontrol, supernatan bakteriosin tanpa perlakuan
 37

4.2 Pembahasan

Penelitian ini menggunakan media Mueller Hinton Agar dan Mueller

Hinton Broth jenis media ini biasanya digunakan untuk uji sensitivitas antibiotik.

Sampel uji yang digunakan merupakan tiga jenis bakteri asam laktat yaitu

L.acidhopilus, L.bulgaricus, dan L.casei sedangkan bakteri uji yang digunakan

yaitu P.aeruginosa. Untuk memastikan bakteri tersebut benar maka terlebih

dahulu dilakukan uji penegasan terhadap strain bakteri sampel maupun bakteri uji.

Uji penegasan yang dilakukan meliputi pemeriksaan morfologi bakteri dan

pengujian sifat biokimia.

Setelah uji penegasan kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri

terhadap P.aeruginosa menggunakan dua metode yaitu metode difusi agar untuk

melihat luas zona hambat yang dihasilkan oleh supernatan bakteriosin dan metode

mikrodilusi untuk mengetahui nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) dan

nilai konsentrasi bunuh minimum (KBM) dari supernatan bakteriosin.

Tabel 4.3 Hasil uji ketahanan terhadap pH menunjukkan aktivitas

penghambatan metabolit terhadap bakteri kontrol yang dihasilkan bakteriosin

L.casei cenderung stabil pada pH asam sedangkan bakteriosin L.acidophilus dan

L.bulgaricus mampu bertahan sampai pH basa tetapi tidak aktif pada paparan basa

kuat (pH >9). Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Dhewa (2012)

bahwa bakteriosin yang berasal dari Lactobacillus sp memiliki aktivitas

antibakteri pada kisaran pH 4-7 tetapi aktivitasnya menurun atau tidak aktif

setelah terpapar pH diatas 8.(28)

 38

Tabel 4.4 menunjukkan bahwa supernatan bakteriosin memiliki aktivitas

antibakteri terhadap P.aeruginosa. Ketiga supernatan bakteriosin yang diuji

dengan metode difusi menunjukkan aktivitas antibakteri yang relatif sama ditandai

dengan terbentuknya zona hambat terbesar dihasilkan oleh bakteriosin yang

berasal dari L.acidophilus dan L.bulgaricus terhadap P.aeruginosa dengan

diameter berturut-turut sebesar 11,4 ± 0,64 mm dan 11,4 ± 0,62, sedangkan untuk

bakteriosin yang berasal dari L.casei memiliki diameter zona hambat yang lebih

kecil yaitu sebesar 9,5 ± 0,28.

Kontrol positif ciprofloksasin digunakan untuk mengetahui bahwa

P.aeruginosa sensitif terhadap antibiotik tersebut dengan melihat diameter zona

bening yang terbentuk yaitu sebesar 21,05 ± 0,21. Kontrol negatif menggunakan

NaCl fisiologis steril, aquadest steril, dan MRS broth menunjukkan hasil negatif

yaitu tidak ada zona hambat hal ini menunjukkan bahwa kontrol negatif tidak

memberikan pengaruh dalam menghambat pertumbuhan P.aeruginosa.

Tabel 4.5 menunjukkan hasil pengujian aktivitas antibakteri dengan

metode mikrodilusi terhadap P.aeruginosa diketahui nilai KHM dan KBM dari

ketiga supernatan bakteriosin memberikan hasil relatif sama. KHM ketiga

supernatan bakteriosin rata-rata memberikan hasil positif pada konsentrasi 6,25%

sedangkan KBM dari ketiga supernatan bakteriosin rata-rata berada pada

konsentrasi 12,5% dengan KBM terendah sebesar 25% ditunjukkan oleh

bakteriosin L.casei.

Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa supernatan bakteriosin

Lactobacillus sp dapat menghambat pertumbuhan P.aeruginosa. Hal ini sesuai

 39

dengan penelitian yang dilakukan Citra (2013) bahwa antibakteri dalam yoghurt

yang berasal dari L.bulgaricus dapat menghambat pertumbuhan P.aeruginosa.

Diperkuat dengan hasil penelitian yang dilakukan Al-Mathkhury (2011)

bakteriosin yang dihasilkan L.acidophilus mampu menghambat pertumbuhan

P.aeruginosa.(29, 30)

Tabel 4.6 menunjukkan hasil pengujian bakteriosin yang dikontakkan

dengan berbagai derajat pH. Hasil uji menunjukkan bakteriosin L. acidophilus

memberikan hambatan pada kisaran pH 3-9 (pH asam sampai basa) dan pada

kisaran pH > 9 tidak terjadi penghambatan terhadap bakteri uji. Bakteriosin L.

bulgaricus hambatan terhadap bakteri uji terjadi pada kisaran pH 3-10 dan pada

kisaran pH > 10 tidak terjadi penghambatan terhadap bakteri uji. Berbeda dengan

bakteriosin L. acidophilus dan L. bulgaricus, bakteriosin L. casei memberikan

hambatan terhadap bakteri uji dalam rentang pH yang lebih sempit yaitu pH 3-7

(pH asam sampai netral) dan pada pH > 7 sudah tidak ada penghambatan terhadap

bakteri uji. Hal ini sesuai dengan hasil uji ketahanan sifat metabolit bakteriosin

terhadap pH. Adanya perbedaan daya hambat dikarenakan perbedaan jenis

Lactobacillus sehingga spesies yang berbeda menghasikan hambatan yang beda

berdasarkan ketahanan komponen metabolit yang dihasilkan.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteriosin L.acidophilus dan

L.bulgaricus memiliki aktivitas lebih tinggi dibanding dengan bakteriosin L. casei

dalam menghambat pertumbuhan P.aeruginosa diduga bahwa bakteriosin yang

dihasilkan oleh kedua sampel uji memiliki ketahanan metabolit tidak hanya pada
 40

pH asam tetapi pada pH basa sehingga mampu menghambat pertumbuhan bakteri

uji.

Bakteriosin yang dihasilkan Lactobacillus sp mampu melemahkan

permeabilitas P.aeruginosa dengan merusak membran sel. Kemudian menembus

sitoplasma sehingga sel menjadi lisis. Permeabilitas membran dilindungi berupa

lapisan lipopolisakarida yang terletak pada permukaan sel yang kemudian dirusak

oleh asam laktat sehingga substrat bakteriosin dapat masuk ke dalam membran

sitoplasma sehingga menyebabkan sel P.aeruginosa mati. (31)