IDENTIFIKASI MIKROBA

SECARA BIOKIMIA
 IDENTIFIKASI MIKROBA

o Uji biokimia dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat fisiologis koloni bakteri

hasil isolasi.
o Biokimia bakteri berkaitan dengan proses metabolisme sel bakteri.
o Identifikasi bakteri tidak dapat dilakukan dengan mengetahui sifat
morfologinya saja, namun harus mengetahui sifat fisiologis bakteri juga.
o Sifat fisiologis bakteri sangat penting diketahui apabila melakukan
identifikasi bakteri karena sifat morfologis bakteri dapat tampak serupa
bahkan tidak dikenal sehingga dengan melakukan uji biokimia terhadap
koloni bakteri dapat mengetahui sifat dan menentukan spesies bakteri.
 IDENTIFIKASI MIKROBA

Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Uji Katalase

Uji Gelatin

Uji Urease

Uji LIA (Lysine Iron Agar)

Uji Uji Oksidase

Biokimia Uji O/F (Oksidatif/ Fermentatif)

Uji Citrate

Uji Indole

Uji MR (Methyl Red)

Uji VP (Voges Proskauer)

Uji Motilitas
 IDENTIFIKASI MIKROBA

1. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

o Uji TSIA bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang berasal dari kelas
Enterobacteriaceae.
o Uji TSIA merupakan uji untuk melihat kemampuan bakteri dalam
memfermentasikan karbohidrat (glukosa, laktosa, sukrosa)
o Medium TSIA mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa, dan
sukrosa serta terdapat indikator fenol merah dan FeSO4 untuk
memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya
endapan hitam. 
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokulasi ke dalam media TSIA
dengan cara menusuk tegak lurus pada bagian butt (tusuk/ dasar) dan
cara zig zag pada bagian slant (miring) dan dinkubasi selama 24 jam
pada suhu kamar.
 IDENTIFIKASI MIKROBA

1. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

o Hasil uji TSIA dapat diketahui :

 Bakteri dapat memfermentasi glukosa saja ditandai dengan warna kuning (asam)
pada dasar media dan berwarna merah pada lereng (basa) Alk/A atau Alkali/Acid.
 Bakteri dapat memfermentasi laktosa dan sukrosa ditandai dengan warna merah
(basa) pada dasar media dan berwarna kuning pada lereng (asam) A/Alk atau
Acid/Alkali.
 Apabila bakteri dapat memfermentasi semua karbohidrat ditandai dengan warna
kuning pada dasar media (asam) dan berwarna kuning juga pada lereng media
(asam) A/A atau Acid/Acid.
 Apabila bakteri tidak dapat memfermentasi semua karbohidrat ditandai dengan
warna merah pada dasar media (basa) dan berwarna merah juga pada lereng
media (basa) Alk/Alk atau Alkali/Alkali
 Pembentukkan H2S ditandai dengan perubahan warna menjadi hitam dan adanya
gas ditandai dengan terbentuknya rongga-rongga dibagian bawah agar.
IDENTIFIKASI MIKROBA

1. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

HASIL :
a. (+) glukosa = kuning
dasar, merah lereng
b. (+) laktosa, sukrosa
= merah dasar,
kuning lereng
c. (+) karbohidrat =
kuning dasar, kuning
lereng
d. (-) Karbohidrat =
merah dasar, merah
lereng
 IDENTIFIKASI MIKROBA
2. Uji Katalase

o Uji katalase berfungsi untuk mengetahui mampu atau tidaknya bakteri

memproduksi enzim katalase.
o Enzim katalase adalah enzim yang dapat menguraikan hidrogen peroksida
(H2O2) menjadi oksigen (O2) dan air (H2O).
o Bakteri yang mempunyai enzim katalase (katalase positif) mampu
melindungi selnya dari efek hidrogen peroksida (H2O2).
o Hidrogen peroksida (H2O2) secara alami dihasilkan oleh bakteri dari
metabolisme karbohidrat secara aerobik.
 IDENTIFIKASI MIKROBA
2. Uji Katalase

o Tujuan dan penggunaan uji katalase pada bakteri :

 Uji katalase digunakan untuk membedakan bakteri  Enterococcusor
Streptococcus dan Staphylococcus yang secara morfologi hampir
sama. Enterococcusor Streptococcus merupakan katalase negatif
sedangkan Staphylococcus merupakan katalase positif.
 Uji katalase digunakan untuk membedakan bakteri aerobik dan
bakteri obligate anareobik
 Uji katalase digunakan untuk membedakan bakteri Clostridium dan
bakteri Bacillus. Bakteri Clostridium merupakan katalase negatif
sedangkan bakteri Bacillus merupakan katalase positif.
 Uji katalase digunakan untuk identifikasi Enterobacteriaceae
 IDENTIFIKASI MIKROBA
2. Uji Katalase
Cara kerja:
 Sebanyak 2 tetes H2O2 diletakkan pada kaca objek steril. Isolat bakteri
diambil menggunakan jarum ose steril, kemudian dipindahkan ke atas
kaca objek dan dicampurkan

HASIL :
a. Katalase (+) =
terbentuk
gelembung setelah
ditetesi H2O2
b. Katalase (-) = tdk
terbentuk
gelembung setelah
ditetesi H2O2
 IDENTIFIKASI MIKROBA

3. Uji Gelatin

o Uji gelatin bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri memiliki

enzim gelatinase yang mampu mengidrolisis gelatin atau tidak.
o Mikroorganisme dapat membentuk enzim semacam proteolitik
(gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin.
o Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen, yaitu zat
pada jaringan penghubung dan tendon pada hewan.
o Pada suhu rendah, media gelatin akan memadat sedangkan pada suhu
kamar gelatin berwujud cair
 IDENTIFIKASI MIKROBA

3. Uji Gelatin

o Hidrolisis gelatin juga dapat digunakan untuk mengetahui patogenisitas

suatu bakteri. Produksi gelatinase dapat dihubungkan dengan kemampuan
si bakteri merusak jaringan kolagen dan menyebar dalam tubuh inang.
o Contohnya, Clostridium perfringens akan mencairkan gelatin jika beraa
dalam medium gelatin,sementara Bacterioides fragilis tidak.
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokulasikan pada media cair
gelatin dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar
 Hasil positif ditunjukkan dgn gelatin tetap dalam keadaan cair
walaupun telah didinginkan. Artinya reaksinya bersifat irreversibel
(tidak dapat balik), di mana media gelatin akan tetap cair meskipun
telah didinginkan dengan es.
 Hasil negatif dtunjukkan dgn membekunya media gelatin setelah
didinginkan dengan es
IDENTIFIKASI MIKROBA

3. Uji Gelatin

HASIL :
a. Gelatin (+) = media
gelatin cair*
b. Gelatin (-) = media
gelatin membeku*

*(setelah ditempatkan
di lemari es)
 IDENTIFIKASI MIKROBA

4. Uji Urease

o Uji urease berfungsi untuk mengetahui kandungan enzim urease pada

bakteri sehingga dapat menguraikan urea membentuk amoniak
o Urea broth merupakan media differensial yang dapat membedakan
bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim urease
o Kandungan Urease broth meliputi Buffer, Urea, sedikit nutrient, indicator
phenol red.
o Phenol red berubah jadi kuning apabila lingkungan asam dan berubah
merah muda apabila lingkungan basa.
o Prinsip uji urease yaitu media urea terdegradasi menjadi amoniak
menyebabkan lingkungan basa, maka media menjadi merah muda
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokulasikan secara zig zag pada
permukaan agar miring media Urea Broth dan tambahkan indicator
fenol merah. Inkubasi selama 24 jam pada suhu kamar.
IDENTIFIKASI MIKROBA

4. Uji Urease

HASIL :
a. Urease (+) = warna
merah
b. Urease (-) = warna
kuning
 IDENTIFIKASI MIKROBA
5. Uji Lisin Iron Agar

o Uji LIA pada bakteri bertujuan untuk melihat kemampuan mikroorganisme

dalam mendekarboksilase lisin membentuk amin kadaverin yang bersifat
basa,
o Mikroba yang mampu mengunakan lysin sebagai sumber karbon biasanya
memiliki enzim lysin dekarboksilase di dalam selnya
o Ketika lysin dikonsumsi maka akan menghasilnkan senyawa yang dapat
meningkatkan pH dari medium dan dapat diamati dgn menggunakan
indikator Brom Cresol Purple (BCP).
o Indikator ini akan ungu pada pH netral atau basa dan akan berubah
warnamenjadi kuning pada pH di bawah 5,2.
 IDENTIFIKASI MIKROBA
5. Uji Lisin Iron Agar
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokulasi secara tusuk lalu zig zag
pada permukaan agar miring LIA
 Mikroba harus mengunakan glukosa terlebih dahulu sehingga
menyebabkan pH medium menjadi turun di bawah 5,2 sehingga akan
diamati perubahan media dari ungu menjadi kuning setelah 24 jam
inkubasi.
 Setelah pH medium turun maka enzim lysin dekarboksilase diaktifkan
oleh sel mikroba.
 Kultur selanjutnya diinkubasi lagi selama 24 jam sehingga mikroba
sekarang mengunakan lysine sebagai sumber karbon dan merubah pH
medium menjadi basa kembali.
 Setelah 48 akan diamati perubahan warna dari kuning menjadi ungu
lagi.
 Kegagalan terjadi jika medium tidak berubah menjadi kuning dalam
waktu 24 jam atau tidak berubah menjadi ungu dalam waktu 48 jam.
 IDENTIFIKASI MIKROBA
5. Uji Lisin Iron Agar

o Hasil :
 Uji LIA positif ditandai dengan perubahan warna dari coklat menjadi
warna ungu pada indikator bromkresol ungu.
 Uji LIA negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna
pada indikator bromkresol ungu
 Reaksi ini dapat disertai atau tidak disertai dengan pembentukan gas
(adanya gelembung/pecahnya agar di daerah tusukan atau adanya
endapan hitam)
IDENTIFIKASI MIKROBA
5. Uji Lisin Iron Agar

HASIL :
a. LIA (+) = warna ungu
b. LIA (-) = tdk terjadi
perubahan warna
pada media
 IDENTIFIKASI MIKROBA
6. Uji Oksidase

o Pengujian oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya enzim oksidase

pada bakteri.
o Uji oksidase bertujuan untuk menentukan bakteri enteric
(Enterobacteriaceae) atau non enteric (genus Neisseriadan Pseudomonas)
o Enzim sitokrom oksidase akan berubah menjadi bentuk tidak aktif dengan
mereduksi sitokrom c.
o Enzim ini akanmenjadi bentuk aktifnya kembali jika terjadi transfer
elektron ke molekul oksigen.
o Keberadaan oksigen pada enzim oksidase akan mereduksi substan-
substanorganik diantaranya substan yang terdapat pada oxidase test strip
yang mengandung  N,N, N tetramethyl-p-phenylenediamine
o Reaksi tersebut akan menghasilkan molekul indophenol blue yang
mengakibatkan warna test strip akan berwarna biru violet.
o Reaksi ini merupakan reaksi positif untuk bakteri non enterik sedangkan
pada bakteri enterik tidak terjadi perubahan 
IDENTIFIKASI MIKROBA
6. Uji Oksidase

HASIL :
a. Oksidase (+) = warna biru violet
b. Oksidase (-) = tdk terjadi perubahan warna
 IDENTIFIKASI MIKROBA

7. Uji Oksidatif Fermentatif

o Uji oksidatif fermentasi bertujuan untuk mengetahui  apakah suatu bakteri

mampu melakukan fermentasi dan oksidasi, yang ditandai dengan
munculnya warna kuning pada medium OF.
o Cara kerja :
o Inokulasikan secara hati-hati isolate murni bakteri ke dalam 2 tabung berisi
media O-F yang mengandung 0,5-1 % karbohidrat (glukosa, laktosa,
manitol, maltose atau sukrosa) secara tusukan. Tabung I ditutup dengan
paraffin lunak, tabung II tidak ditutup paraffin
IDENTIFIKASI MIKROBA

7. Uji Oksidatif Fermentatif

 IDENTIFIKASI MIKROBA

8. Uji Sitrat

o Uji sitrat dilakukan untuk mendeterminasi kemampuan bakteri

menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon untuk metabolisme.
o Uji sitrat dilakukan dengan menggunakan media Simone Citrate Agar yang
mengandung indicator B2B (Brom Tymol Blue)
o Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media
berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokusikan secara zig zag pada
permukaan agar miring media Simmons Citrat dan diinkubasi selama
24 jam pada suhu kamar.
 IDENTIFIKASI MIKROBA

8. Uji Sitrat

o Hasil :
 negatif (-) : tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau
menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat
permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel.
Sehingga bakteri tidak menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-
satunya sumber karbon
 positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi
biru, artinya bakteri menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-
satunya sumber karbon
IDENTIFIKASI MIKROBA

8. Uji Sitrat

HASIL :
a. Sitrat (+) = warna biru
b. Sitrat (-) = warna hijau
 IDENTIFIKASI MIKROBA

9. Uji Indol

o Uji indol berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri memiliki enzim

triptophanase sehingga bakteri tersebut mampu mengoksidasi asam
amino triptophan membentuk indol.
o Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac’s
yang berisi paradimetil amino bensaldehid.
o Cara kerja :
 Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolate
bakteri. Inkubasi pada suhu kamar 24 jam. Setelah inkubasi, tabung
media ditambahkan 10 tetes reagen Kovacs
 IDENTIFIKASI MIKROBA

9. Uji Indol

o Hasil :
 Negatif (-) : tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol
dari triptophan sebagai sumber karbon.
 Positif (+) : terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan
biakan, artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai
sumber karbon
IDENTIFIKASI MIKROBA

9. Uji Indol

HASIL :
a. Indole (+) = permukaan atas
media membentuk lapisan
cincin berwarna merah
b. Indole (-) = permukaan atas
media membentuk lapisan
cincin berwarna tidak merah
 IDENTIFIKASI MIKROBA

10. Uji Methyl Red (MR)

o Uji MR berfungsi untuk mengatahui ada tidaknya fermentasi asam

campuran (metilen glikon) pada koloni bakteri
o Cara kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri diinokulasikan ke dalam media
MR_VP dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Tambahkan
3-4 tetes reagen Methy Red kr dalam tabung berisi media MR-VP.
Kocoklah hati-hati.
 IDENTIFIKASI MIKROBA

10. Uji Methyl Red (MR)

o Hasil uji MR
 Negatif (-) : media tidak mengalami perubahan warna menjadi merah
setelah ditambah methyl red.
 Positif (+) : media mengalami perubahan warna menjadi merah
setelah ditambah methyl red, dapat diartikan bahwa asam campuran
(metilen glikon) dihasilkan oleh bakteri melalui proses fermentasi
glukosa pada media methyl red.
IDENTIFIKASI MIKROBA

10. Uji Methyl Red (MR)

HASIL :
a. MR (+) = media berwarna
merah setelah ditetesi
methyl red
b. MR (-) = media tidak
berwarna merah setelah
ditetesi methyl red
 IDENTIFIKASI MIKROBA

11. Uji Voges Prokauer (VP)

o Uji VP berfungsi untuk mengetahui hasil fermentasi glukosa membentuk

(asetoin) asetil metil karbinol.
o Cara kerja :
 Inokulasikan isolate murni bakteri pada media MR-VP dan
inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Tambahkan 0,6 ml
larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. Kocoklah hati-
hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit,
bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit.
 IDENTIFIKASI MIKROBA

11. Uji Voges Prokauer (VP)

o Hasil uji VP
 Negatif (-) : tidak mengalami perubahan warna menjadi merah
setelah media ditambahkan reagen a napthol dan KOH
 Positif (+) mengalami perubahan warna menjadi merah setelah media
ditambahkan reagen a napthol dan KOH , dapat diartikan bahwa hasil
fermentasi glukosa dapat membentuk (asetoin) asetil metil karbinol
IDENTIFIKASI MIKROBA

11. Uji Voges Prokauer (VP)

HASIL :
 VP (+) = media berwarna
merah setelah ditetesi a
napthol dan KOH
 VP (-) = media tidak berwarna
merah setelah ditetesi a
napthol dan KOH
 IDENTIFIKASI MIKROBA

12. Uji Motilitas

o Uji motilitas berfungsi untuk mengetahui gerak.

o Cara Kerja :
 Sebanyak satu ose isolate bakteri ditusukkan ke medium uji SIM dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar
o Hasil :
 Negatif (-) ditandai dengan pada bekas tusukan inokulasi saja terdapat
bentukan warna putih sepeti akar yang menyebar.
 Positif (+) ditandai dengan disekitar inokulasi terdapat bentukan
warna putih seperti akar yang menyebar, dapat diartikan bahwa
bakteri yang diinokulasi memiliki flagel sehingga dapat melakukan
pergerakan
IDENTIFIKASI MIKROBA

12. Uji Motilitas

HASIL :
a. Motilitas (+) =
pertumbuhan
bakteri
menyebar
b. Motilitas (-) =
pertumbuhan
bakteri tdk
menyebar
TERIMA
KASIH..