UJI BATAS MIKROBA

ENDAH CAHYANI
A. UJI ENUMERASI MIKROBA
• Pengujian dilakukan pada kondisi aseptik sebagai
tindakan pencegahan untuk menghindari kontaminasi
mikroba dari luar produk, tetapi tidak mempengaruhi
mikroba yang diuji. Jika produk mempunyai aktifitas
antimikroba sebelum diuji lakukan netralisasi
menggunakan inaktivator yang telah dibuktikan tidak
toksik terhadap mikroba yang diuji.
• Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan
Membran atau salah satu Metode Angka Lempeng yang
sesuai. Pemilihan metode pengujian berdasarkan
beberapa faktor antara lain jenis produk yang diuji,
persyaratan yang ditentukan dan ukuran sampel yang
memadai untuk memperkirakan kesesuaian secara
spesifik. Kesesuaian metode yang dipilih harus
ditetapkan.
Penyiapan Galur Mikroba Uji
• Gunakan suspensi mikroba uji terstandar yang stabil.Benih tidak
lebih dari 5 pasase dari master lot benih
• asli. Biakkan tiap galur bakteri dan kapang uji secara
terpisahUntuk membuat suspensi mikroba uji gunakan Dapar
Natrium Klorida-Pepton pH 7,0 atau Dapar fosfat pH 7,2; untuk
memisahkan spora Aspergillus brasiliensis tambahkan polisorbat
80 P 0,05% pada dapar dalam waktu 2 jam atau dalam 24 jamjika
disimpan pada 2º – 8º.Setelah dipilih untuk menyiapkan suspensi
segar sel vegetatif A.brasiliensis atau B.subtilis, siapkan suspensi
spora yang stabil dan gunakan untuk inokulum dalam pengujian
dengan volume yang sesuai. Suspensi spora yang stabil
dipelihara pada 2º – 8º untuk jangka waktu yang tervalidasi.
Kesesuaian Metode Penghitungan Mikroba dalam Sediaan

• PENYIAPAN SAMPEL : Metode penyiapan sampel disesuaikan

dengan sifat fisik sediaan yang diuji. Jika dengan prosedur yang
diuraikan di bawah ini tidak ada yang memuaskan maka harus
dikembangkan prosedur lain yang sesuai. Jika perlu encerkan
dengan pelarut yang sama.
• INOKULASI DAN PENGENCERAN : Aduk perlahan-lahan dan
jika perlu pertahankan suhu dengan waktu sesingkat mungkin
untuk pembentukan emulsi. Cairan atau Padatan dalam bentuk
Aerosol Pindahkan seluruh isi sediaan dengan cara aseptic dalam
penyaring membrane atau wadah steril yang sesuai untuk
pengambilan sampel.
• NETRALISASI/PENGHILANGAN AKTIFITAS ANTIMIKROBA
– Jumlah mikroba dari sampel yang disuspensikan, diinkubasi mengikuti
prosedur yang diperoleh kembali dari suspensi kontrol. Jika pertumbuhan
terhambat, maka lakukan perubahan prosedur untuk perhitungan khusus
untuk meyakinkan validitas hasil.
– Zat penetral digunakan untuk menetralkan aktifitas senyawa mikroba yang
dapat ditambahkan pada pengencer sebelum disterilkan.
– Isolasi mikroba gagal jika tidak ditemukan metode netralisasi yang sesuai
yang menunjukkan sediaan tidak terkontamisasi mikroba uji.
• PEROLEHAN KEMBALI MIKROBA UJI DALAM SEDIAAN
Penyaringan Membran
1. Gunakan penyaring tidak lebih dari 0,45 μm.
2. Untuk menentukan angka lempeng total mikroba aerol,
pindahkan penyaring membran ke permukaan lempeng media
Soybean-Casein Digest Agar (SDCA).
3. Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan
memebran ke permikaan lempeng media Aabouraud Dextrose Agar.
• HASIL DAN INTERPRETASI

– Jika ada kesesuaikan antara metode penyaringan membran

atau metode angka lempeng, hitung jumlah rata-rata mikroba
uji dengan nilai penerimaan tidak lebih dari faktor 2 suspensi
kontrol tanpa sediaan.
– Jika ada kesesuaian dengan metode APM , nilai inokulum yang
dibitung harus dalam batas kepercayaan 95% dari nilai
suspensi kontrol.
PENGUJIAN SEDIAAN
• Jumlah sediaan yang digunakan untuk pengujian
– Jika tidak dinyatakan lain, sediaan uji yang diambil 10 gram
atau 10 ml.
– Untuk sediaan cairan atau padatan dalam aerosol, gunakan 10
wadah sampel.
– Untuk bahan aktif dengan sampel terbatas, sediaan uji yang
diambil harus 1% dari bets
• Pemeriksaan Sediaan
Penyaringan membran
– Untuk menentukan angka lempeng total mikroba aerol, pindahkan
penyaring membran ke permukaan lempeng media Soybean-Casein
Digest Agar (SDCA), inkubasi pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5 hari.
– Untuk menentukan Angka Kapang Khamir (AKK), pindahkan memebran
ke permikaan lempeng media Aabouraud Dextrose Agar, inkubasi pada
suhu 20° - 25° selama 5 - 7 hari.
– Untuk pengujian sampel “thermal patches”, saring secara terpisah 10%
dari volume larutan dan gunakan 2 penyaring membran steril.
• Interpretasi Hasil
- 101 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima =
20;
- 102 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima =
200;
- 103 koloni: maksimal penghitungan yang dapat diterima =
2000; dan seterusnya.
B. PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK

PENYIAPAN GALUR UJI

• Mikroba aerob : Biakkan gakur bakteri dan pisahkan

dalam wadah berisi media SCBD atau SCDA di suhu 30°
- 35° selama 18-24 jam

• Kontrol negatif :Dilakukan menggunakan pelarut yang

sesuai dan tidak boleh terjadi pertumbuhan mikroba.
• Fertilitas dan daya hambat media
– Uji fertilitas media cair : Inokulasikan mikroba uji dalam jumlah
sedikit pada media dan diinkubasi.
– Uji fertilitas media padat : Gunakan metode sebar. Inokulasikan
dan inkubasi di suhu tertentu
– Uji daya hambat media cair atau padat: Inokulasikan mikroba
uji minimal 100 koloni di media dan diinkubasi disuhu tertentu.
Tidak boleh ada pertumbuhan mikroba.
– Test for indicative properties: Gunakan metode sebar.
Inokulasikan dan inkubasi di suhu tertentu.
• Kesesuaian metode uji
– Saat inokulasi suspensi sampel, tambahkan masing-masing
galur mikroba uji tidak lebih dari 100 koloni pada media.
– Modifikasi prosedur uji harus menetralkan aktifitas antimikroba
harus dilakukan.
PENGUJIAN SEDIAAN
• Uji toleransi empedu bakteri gram negatif
– Penyiapan sampel dan pra inkubasi: siapkan sampel 1 dalam 10 volume
pengencer tidak lebih dari 1 gram sampel. Gunakan media SCDB sebagai
pengencer, campur dan inkubasi di suhu 20° - 25° selama 2 -5 jam
– Uji negatif: kecuali dinyatakan lain, gunakan 1 gram sediaan dalam media cair
pengkaya Enterobacteriaceae Mossel. Inkubasi di suhu 30° - 35° selama 4-48
jam. Lalu subkultur di cawan Violet Red Bile Glucise Agar dan inkubasi di suhu
30° - 35° selama 18-24 jam. Jangan sampai ada pertumbuhan koloni.
– Uji kuantitatif :
• Seleksi dan subkultur: inokulasi ke dalam media Enterobacteria Enrichment
Broth Mossel, encerkan sampai 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 gdan inkubasi di
suhu 30° - 35° selama 24-48jam. Lalu subkultur di cawan Violet Red Bile
Glucise Agar dan inkubasi di suhu 30° - 35° selama 18-24 jam.
• Interpretasi : hasil positif jika ada pertumbuhan koloni
• LARUTAN DAN MEDIA KULTUR YANG DISARANKAN

– Larutan dapar persediaan : timbang 34g kalium dihidrogen

fosfat p, masukkan ke dalam labu ukur 1000ml, larutkan dalam
500 ml air, atur pH menjadi 7,2 - 0,2, tambahkan air murni
sampai tanda, dan campur homogen. Masukkan ke dalam
wadah, dan sterilisasi. Simpan pada suhu 2° - 8°
– Larutan dapar fosfat Ph 7,2 : siapkan campuran air murni dan
larutan dapar persediaan dan sterilisasi.