Pirogen, Uji Pirogen

dan Depirogenisasi
Tim Dosen
PIROGEN
 PIROGEN?
 Senyawa yang diinjeksikan ke mamalia:
 Meningkatkan suhu badan (pada dosis rendah)
 Shock (disfungsi jantung, vasodilatasi, vasokonstriksi, disfungsi endotel
dan disfungsi mutiorgan dan kematian
 Menginduksi produksi sitokin inflamasi diikuti oleh demam, koagulasi
darah, hipotensi, limfopneia, neutrofilia, peningkatan kortisol plasma dan
protein fase akut
 Dihasilkan oleh:
 Bakteri (Gram + dan -)
 Mycobacteria
 Jamur
 Virus
 Yang penting dalam bidang farmasi adalah endotoksin
(lipopolisakarida) terdapat pada envelop bakteri Gram -
 PIROGEN
 Jenis pirogen bermacam-macam tergantung dari
bakteri yang menghasilkan dan struktur
kimianya.
 Sumber pirogen yang utama adalah yang berasal
dari endotoksin bakteri gram negatif.
 PIROGEN
 Pirogen endogen: pengatur suhu tubuh
 Pirogen eksogen: endotoksin (gram negatif), pirogen
virus, jamur dan produk bakteri
 Reaksi pirogenik menggigil, muntah, peningkatan suhu,
generalized inflammation
 Pirogen
1. EKSOTOKSIN : Merupakan hasil metabolisme bakteri
Gram (+) dan Shigella dysentriae (Gram -). Berukuran kecil
dan sedikit stabil terhadap panas yang dapat teradsorpsi
dalam bentuk terlarut.
2. ENDOTOKSIN : Merupakan senyawa lipopolisakarida
protein kompleks yang terikat pada membran semua bakteri
Gram (-) seperti Salmonella, Pseudomonas dll. Sifatnya stabil
terhadap panas dan baru in-aktif pada suhu diatas 200oC.
Dapat dihilangkan melalui filter adsorpsi atau ultra filtrasi.
3. PSEUDO PIROGEN : Dibebaskan melalui filter bakteri
4. VIRUS PIROGEN : Di inaktivasi dengan panas
 Sifat Pirogen
Sekali suatu sediaan injeksi tercemar oleh pirogen
akan sulit untuk menghilangkannya karena sifat
pirogen yang :
1. Termostabil  beberapa jenis pirogen baru
dapat dimusnahkan pada suhu tinggi. Misalnya
250oC selama 30 menit atau 200oC selama 1
jam.
2. Secara kimia bersifat lipopolisakarida Larut
air & tidak larut dalam pelarut organik  tidak
dapat dihilangkan dengan penyaringan bakteri
biasa dan cara sterilisasi basah
 Sifat pirogen (lanjutan)
3. Tidak menguap  cukup menguntungkan sehingga
pirogen dapat dihilangkan dengan cara penyulingan
dengan menggunakan alat penyuling yang dilengkapi
dengan unit “baffle” yang telah dirancang khusus untuk
mencegah terbawanya zat-zat yang tidak menguap ke
dalam destilat.
4. Bobot molekul berkisar antara 15.000 – 4.000.000
5. Pirogen ukurannya lebih kecil dari pori-pori membran
0,22 m! Jadi pirogen lolos filtrasi membran
 SUMBER PIROGEN
 AIR
 PERALATAN

 WADAH DAN TUTUPNYA

 BAHAN KIMIA YANG DIGUNAKAN

 SENTUHAN (PERSONAL)
 Mengapa pirogen tidak boleh ada dalam
sediaan parenteral volume besar?
1. Volume sediaan yang besar akan mengandung
pirogen dalam jumlah yang besar pula.
2. Sediaan injeksi dengan volume besar biasanya
diberikan secara intravena sehingga efek
pirogenik akan timbul dengan cepat.
3. Pasien yang menerima cairan infus biasanya
mempunyai penyakit yang parah sehingga efek
pirogen yang menaikkan suhu tubuh dapat
menimbulkan bencana.
PEMBEBASAN PIROGEN & UJI
PIROGEN
 PEMBEBASAN PIROGEN
Hanya dilakukan untuk larutan sejati obat suntik dengan pembawa
air yang diinjeksikan sebanyak 10 mL atau lebih sekali suntik.
A. PEMBAWA AIR :
1. Ditambahkan 10 mL larutan KMNO4 0,1 N dan 5 mL larutan
NaOH 1 N per liter larutan, sewaktu aquadest disuling.
2. Ditambahkan H2O2 0,1% dan dimasak selama 1 jam.
3. Disaring melalui filter adsorpsi yang terbuat dari asbes
selulosa.
4. Ditambahkan karbon aktif 0,1% dari volume total, dipanaskan
pada suhu 60-70oC selama 10-15 menit sambil diaduk-aduk.
5. Melalui metode elektroosmosis atau reverse osmosis
6. Dengan filtrasi molekuler (Pellicon)
 B. Zat Aktif
 Disinari dengan sinar γ (Co60)
 Dipanaskan pada suhu 200oC selama 1 jam.
 Zat aktif yang tidak tahan pemanasan disaring
secara bertingkat melalui membran khusus.
 Dilarutkan lebih dulu kemudian dibebas
pirogenkan dengan cara memanaskannya dalam
autoklaf suhu 121-124oC selama 2 jam.
 C. ALAT
 Dilakukan dengan metode kimia melalui
penambahan asam krom sulfat atau asam nitrat
kemudian dicuci dengan air bebas pirogen.
 Autoklaf suhu 121-124oC selama 2 jam
 Dipanaskan dalam larutan fenilmerkuri borat
0,002% selama 30 menit.
 Teknik penyinaran atau menggunakan etilen
oksida.
 Uji Pirogen
1. Uji dengan mengukur suhu tubuh kelinci sehat
yang disuntik dengan sediaan injeksi steril yang
akan diuji secara intravena  dapat digunakan
untuk semua jenis pirogen.
2. Uji Limulus, yaitu menggunakan binatang
sejenis kepiting (Limulus polypohemus). Uji
limulus spesifik untuk endotoksin yang berasal
dari bakteri gram negatif.
 Uji Pada Kelinci
 Lakukan pengujian dalam ruang terpisah yang khusus untuk uji pirogen
dan dengan kondisi lingkungan yang sama dengan ruang pemeliharaan,
bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan.
 Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian.
 Apabila pengujian menggunakan termistor, masukkan kelinci ke dalam
kotak penyekap sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak
leher yang longgar sehingga dapat duduk dengan bebas.
 Tidak lebih dari 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan
”suhu awal” masing-masing kelinci yang merupakan dasar untuk
menentukan kenaikan suhu.
 Beda suhu tiap kelinci tidak boleh lebih dari 1o dan suhu awal setiap
kelinci tidak boleh > 39,8o.
 Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, suntikan 10 ml
per kg bobot badan, melalui vena tepi telinga 3 ekor kelinci dan
penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit.
 Larutan uji berupa sediaan yang bila perlu direkonstitusi seperti yang
tertera pada etiket maupun bahan uji yang diperlakukan seperti yang
tertera pada masing-masing monografi dan disuntikan dengan dosis
seperti yang tertera.
 Untuk uji pirogen alat atau perangkat injeksi, gunakan sebagai larutan
uji hasil cucian atau bilasan dari permukaan alat yang berhubungan
langsung dengan sediaan parenteral, tempat penyuntikan atau jaringan
tubuh pasien.
 Semua larutan harus bebas dari kontaminasi. Hangatkan larutan pada
suhu 37±2º sebelum penyuntikan. Rekam suhu berturut-turut antara
jam ke-1 dan ke-3 setelah penyuntikan dengan selang waktu 30 menit.
 Penafsiran hasil
 Setiap penurunan suhu dianggap nol.
 Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun
menunjukan kenaikan suhu 0,5º atau lebih lanjutkan
pengujian dengan mengunakan 5 ekor kelinci.
 Jika tidak lebih dari 3 ekor dari 8 ekor kelinci masing-
masing menunjukan kenaikan suhu 0,5º atau lebih dan
jumlah kenaikan suhu maksimum 8 ekor kelinci dan
tidak > 3,3º sediaan dinyatakan memenuhi syarat bebas
pirogen.
 UJI LIMULUS
 Beberapa enzim yang terdapat pada sel darah
amubosit limulus dapat distimulasi oleh
endotoksin bakteri sehingga terjadi koagulasi
enzim yang diakhiri dengan pembentukan gel.
 Gel yang terbentuk karena interaksi antara
endotoksin dengan reagen uji limulus dapat
dievaluasi dengan berbagai cara : uji titik akhir
gumpalan gel, turbidimetri, uji substrat
kromogenik.
DEPIROGENISASI
 BEBAS PIROGEN
 SEDIAAN INTRA VENA

 SEDIAAN ANTIBIOTIK

 BAHAN BAKU DAN SEDIAAN:

MENGANDUNG PROTEIN
REKOMBINAN DIPRODUKSI PADA
Escherichia coli
 Depirogenisasi
Inaktivasi endotoksin Menghilangkan endotoksin
 Hidrolisis asam basa :  Pembilasan
menurunkan atau  Destilasi
menghilangkan aktivasi  Ultrafiltrasi
biologi lipopolisakarida
 Reverse osmosis (RO)
bakteri
 Karbon aktif
 Alkilasi : asam anhidrat 
menurunkan pirogenitas
endotoksin
 Oksidasi : dicuci dengan
H2O2 (Salmonella Typo)
TERIMAKASIH