BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
A. Definisi
1. Pyrogen
Ensiklopedia Vol.II : 203
Pirogen atau bakteri endotoksin adalah produk metabolit dari pertumbuhan
mikroba. Pirogen larut air, lipopolisakarida tahan panas dan tidak dapat dihancurkan
melalui sterilisasi uap atau filtrasi
Ansel : 339
Pirogen adalah senyawa oganik yang menimbulkan demam, berasal dari
pengotoran mikroba dan merupakan penyebab banyak reaksi-reaksi fibril yang
timbul pada penderita yang menerima suntukan i.v
Scovilles : 195
Istilah pirogen berarti memproduksi demam, pirogen ini dimana merupakan
bahan-bahan yang dibentuk oleh mikroorganisme, kadang-kadang hadir dalam cairan
parenteral dan memproduksi reaksi demam ketika larutan dinjeksikan pada pasien.
RPS 18 th :1590
Pirogen adalah merupakan produk pertumbuhan mikroorganisme. Bahan pirogenik
yang paling berbahaya adalah yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif (endotoksin)
tetapi gram positif dan fungi juga menghasilkan bahan pirogenik yang kurang
berbahaya
SDF : 44
Pirogen disefinisikan sebagai produk metabolit dari mikroorganisme hidup atau
mikroorganisme mati yang menyebabkan respon piretik spesifik setelah
penyuntikan.
2. Definisi Endotoksin
Endotoksin merupakan suatu produk mikroorganisme terutama dari bakteri gram
negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks lipopolysaccharida yang
pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang innert. Pada saat ini endoktoksin
diketahui merupakan pirogen yang paling, kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam
suatu sediaan perlu diperhitungkan; karena manusia tidak hanya respon terhadap
endoktoksin saja tetapi juga pirogen yang lain (Suwandi,1988).
B. Cara Uji Pirogen
Uji pirogen (FI IV 908-909)
Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi resiko reaksi demam pada tingkat
yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Pengujian meliputi
pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan larutan uji secara i.v dan

ditujukan untuk sediaan yang perlu penyiapan pendahuluan atau cara pemberiannya
perlu kondisi khusus ikuti petunjuk tambahan yang tertera pada masing-masing
monografi.
Alat dan pengencer. Alat suntik, jarum dan alat kaca dibebas pirogenkan
dengan pemanasan pada suhu 250o C selama tidak kurang dari 30 menit atau
dengan cara lain sesuai dengan perlakuan semua pengencer dan larutan untuk
pencuci dan pembilas alat suntik dengan cara sedemikian rupa yang dapat menjamin
alat tersebut steril dan bebas pirogen. Lakukan uji pirogen terhadap pengencer dan
larutan pencuci dan pembilas secara berkala. Apabila digunakan injeksi NaCl sebagai
pengencer, gunakan injeksi yang mengandung larutan NaCl PO 9 %.
1. Rabbit Test
Rekaman suhu. Gunakan alat pengukur suhu yang teliti seperti termometer klinik
atau termistor atau alat sejenis yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian
skala kurang lebih 0,1 yang telah diuji bahwa pembacaan suhu maximum tercapai <5
menit masukkan alat pengukur suhu kedalam anus kelinci dengan kedalam tidak < 7,5
cm dan sesudah jangka waktu tudak kurang dari yang telah ditetapkan sebelumnya,
tekan suhu tubuh kelinci.
Hewan uji. Gunakan kelinci dewasa yang sehat. Tempatkan kelinci satu ekor dalam
satu kandang dalam ruang dengan suhu yang seragam antara 20-23 o dan bebas dari
gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Beda suhu tidak boleh berbeda kurang
lebih 3o dari suhu yang telah ditetapkan. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan
untuk uji pirogen, adaptasikan kelinci tidak boleh lebih dari tujuh hari dengan uji
pendahuluan yang meliputi semua tahap pengujian yang tertera pada prosedur,
kecuali penyuntikan, kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali
dalam waktu 48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila
menunjukkan kenaikan suhu maksimal 0,6o atau lebih.
Prosedur. Lakukan pengujian dalam ruang terpisah yang khusus untuk uji pirogen dan
denagn kondisi lingkungan yang sama dengan ruang pemeliharaan, bebas dari
keributan yang menyebabkankegelisahan. Kelinci tidak diberi makan selama waktu
pengujian. Minum dibolehkan pada tiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian.
Apabila pengujian menggunakan termistor, masukkan kelinci kedalam kotak
penyekap sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak leher yang longgar
sehingga dapat duduk dengan bebas. Tidak lebih dari 30 menit sebelum penyuntikan
larutan uji, tentukan suhu awal masing-masing kelinci yang merupakan dasar untuk
menentukan kenaikan suhu. Beda suhu tiap kelinci dalam satu kelompok tidak boleh
lebih 1o dan suhu awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39,8o
Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, suntikkan 10 ml/kg bb,
melalui vena tepi telinga 3 ekor kelinci dan penyuntikan dilakukan waktu 10 menit.

Larutan uji berupa sediaan yang bila perlu yang dikonstitusi seperti yang tertera
pada masing-masing monografi dan disuntikkan dengan dosis seperti yang tertera.
Untuk uji pirogen alat atau perangkat injeksi, gunakan sebagai larutan uji hasil
cucian atau bilsan dari permukaan alat yang berhubungan langsung dengan sediaan
parenteral, tempat penyuntikan atau jaringan tubuh pasien. Semua larutan harus
bebas dari kontaminasi. Hangatkan larutan pada suhu 37 o + 2o sebelum penyuntikan.
Rekam suhu berturut-turut antara jam ke-1 dan jam ke-3 setelah penyuntikan
dengan selang waktu.
Penafsiran hasil. Setiap penurunan suhu dengan nol. Sediaan memenuhi syarat
apabila tak seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,5 o atau lebih. Jika ada
kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5 o atau lebih. Lanjutkan pengujian dengan
menggunakan lima ekor kelinci. Jika tidak lebih dari tiga ekor dari 8 ekor kelinci
masing-masing menunjukkan kenaikan suhu 0,5 o atau lebih dan jumlah kenaikan suhu
maksimal 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3 o sediaan dinyatakan memenuhi syarat
bebas pirogen.
2. LAL
Baru-baru ini telah ditemui bahwa ekstrak sel darah ketam sepatu kuda (Limulus
polyphemus) mengandung system enzim dan protein yang menggumpal bila ada
liposakarida dalam jumlah kecil. Penemuan ini, merangsang perkembanga uji Limulus
amebocyte lysate (LAL) untuk mengetahui adanya pirogen dalam kerja penelitian
dan pengawasan selama proses berlangsung. Usulan-usulan untuk uji produk akhir
obat dengan LAL sedang dipertimbangkan oleh FDA. (Ansel, 1989)
Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang
signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan peralatan medis. Test
didasarkan pada mekanisme primitive penggumpalan darah dari kepiting seperti
Kuda Amerika (Limulus polyphemus). Berberapa enzim diletakkan pada sel darah
amoeba kepiting yang dipicuh oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik
yang di akhiri dengan produksi di gel protenose. (Pharmaceutical Practice, 1990)
Test harus dihindarkan dari kontaminasi antimikroba sebelum dihindarkan, test ini
penting untuk memastikan bahwa tidak ada factor campuran dalam sediaan,
peralatan tidak menyerap endotoksin (seperti pada beberapa plastic) dan
sensitifitas dari lisat diketahui. (Pharmaceutical Practice, 1990)
Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di mubasit limulus. Volume setara
reagen LAL dan larutan test (0,1 mikron per masing-masing)dicampurkan dalam
gelas tube test elipirogenasi. Tube diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 jam,
setelah test wadah dibaca. Tube diambil dari incubator dan diubah. Bekuan oleh
yang rusak mengandung energy padatan merupakan factor dari test positif. Ketika

digunakan pada bagian ini bekuan gel uji awalnya, melewati test kegagalan dibatasi
dan reagen sensitive LAL. (Pharmaceutical Practice, 1990)
Test LAL tambahan test ini dapat digunakan dalam laboratorium farmaseutikal.
Test ini spesifik untuk endotoksin gram negative, dimana test pirogen kelinci
sensitive untuk semua pirogen endotoksin dan sumber lain disbanding gram negative.
(Pharmaceutical Practice, 1990)
3. Kuantitatif dan Kualitatif
1. Hidrolisis Asam Basa
Despirogenasi menggunakan hidrolisis asam basa/alkali menurunkan atau
menghilangkan aktivasi biologi dari lippolisakarida bakteri dengan aktivasi lemak A.
Lemak A adalah rantaiinti polisakarida atau 2 keto 3 asam dioksiketon. Rantai asam
8 karbon asam gula khusus dari LPS bakteri Hidrolisis asam aktif pada asam labil
ketosidik ini pada inti yang terpisah dari lemak A dari sisa molekul LPS.
2. Oksidasi
Pengetahuan tentang inaktivasi oksidasi dari endotoksin dapat ditemukan ketika
Hanrd melaporkan bahwa sel Salmonella Typosa menghilangkan kapasitas produksi
demam ketika dicuci dengan H2O2. Dari asam lemak yang dihasilkan dalam lemak A
dari LPS dapat dianjurkan.
3. Alkilasi
Endotoksin dilaporkan dengan bahan pengalkil menurunkan pirogenitas endotoksin
dihilangkan dengan asam anhidrat. Grup yang sama dilaporkan lapisan diturunkan
ketika endotoksin digunakan dengan subsinat anhidrat. Disamping mekanisme reaksi
ini secara perlahan dengan asetilasi.
C. Metode penghilangan Pyrogen
Cara menghilangkan pirogen
a. PTM : 139
Pirogen dapat dipindahkan dari suatu larutan melalui destilasi dan ini merupakan
metode paling tua untuk memperoleh air bebas progen, dasar untuk memperoleh
atau memproduksi parenteral volume besar bebas pirogen dalam skala besar.
Ultrafiltrasi sampai 100 KD adalah alat yang efektif dari penyaringan endotoksin
yang mempunyai BM kira-kira 20 KD tetapi pada kenyataannya ukuran agregat paling
kurang 1000 KD. Osmosa balik juga efektif memindahkan partikel samapai 1 nm,
meliputi endotoksin. Disisi lain, norit aktif, serat asbes dan polipropilen atau
politeffiber atau permukaan, seluruhnya efektif menyerap pirogen, utamanya
melalui interaksi hidrofobik. Pirogen atau endotoksin yang diadsorbsi dalam
permukaan lebih sulit untuk di pindahkan. Permukaan elestomerik seperti pada segel
dan penutup tidak dapat dipanaskan. Pirogen disini disyaratkan untuk dipindahkan

melalui pembilasan dengan air apirogenik. Banyak permukaan logam atau gelas dapat
diolah secara kimia, kebanyakan bahan pengoksidasi seperti peroxid atau
permanganat menjadi efektif. Sterilisasi panas kering tidak efektif, tekanan pada
20 psig disyaratkan selama paling kurang 5 jam untuk menghancurkan kebanyakan
endotoksin. Metode depirogenisasi ini di pilih untuk permukaan adalah panas kering
pada suhu sekitar 160-250oC paling kurang 30 menit kondisi yang baik yang telah
diset. Pengolah ini mengasumsikan bahwa peralatan pada bagian permukaan dapat
dipanaskan, dan tentu saja sangat sedikit produk yang dapat diolah dengan cara ini.
Wdah gelas, setelah pencucian dengan air untuk injeksi, dikeringkan dan dipanaskan
di bawah kondisi aliran laminar pada oven berkesinambungan suhu 250oC atau lebih
tinggi. Kondisi ini meliputi kombinasi pengeringan, oksidasi dan pembakaran untuk
menghancurkan bahan pirogen.
b. SDF : 46-47
Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi
bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Air untuk injeksi,
ketika dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang
dari 24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilkan pada periode ini. Jika
air untuk injeksi disimpan untuk waktu lebih panjang, air untuk injeksi dapat
disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5-80oC suhu dimana
mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan pirogen. Pirogen
dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas melalui panas kering. Ketika metode
tidak praktis untuk ukutan wadah atau bukan metode pilihan untuk alat-alat pada
panas kering, pirogen dapat dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik
dengan air untuk injeksi bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui
pembilasan yang diulang.
c. RPS 18th : 1850
Pirogen dapat dihancurkan melalui pemanasan pada temperatur tinggi. Prosedur yang
direkombinasikan untuk depirogenasi gelas dan peralatan adalah pemanasan pada
suhu 250oC selama 45 menit. Telah dilaporkan bahwa 650o selama 1 menit atau
selama 4 jam diharapkan dapat menghancurkan pirogen. Hal itu dipastikan bahwa
pencucian yang teliti dengan deterjen akan menjadikan wadah gelas bebas pirogen
jika dilindungi selama proses produksi dan penyimpanan dari kontaminasi pirogen
berat. Putaran autoklaf biasa tidak bisa melakukan hal ini. Pemanasan dengan alkali
kuat dan atau larutan oksidasi akan menghancurkan pirogen. Suatu metode yang
digunakan untuk memindahkan pirogen dari larutan adalah adsobsi dalam bahan
adsortif. Namun, karena fenomena adsorbsi juga dapat menyebabkan pemindahan
selektif dari bahan kimia dari larutan dan filtrat dapat dikontaminasi dengan bahan,
metode ini dibatasi penggunaannya.

==============================================================

BAB III
PEMBAHASAN
Pada tahun 1923 Seibert membuktikan bahwa pirogen adalah substansi yang
tidak tersaring, thermostabil, dan non volatile. Pada tahun 1937 Co Tui
membuktikan bahwa kontaminasi pirogen ini juga terjadi pada alat-alat seperti
wadah-wadah untuk melarutkan obat suntik, juga pada zat kimia yang digunakan
sebagai zat berkhasiat. Pirogen dapat bersumber dari:
Pelarut
Zat aktif
Peralatan
Timbul pada proses penyimpanan
Sifat sifat pirogen:

Thermostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu

650C selama 1 menit, 250C selama 15 menit atau 180C selama 4 jam;

Larut dalam air. Sehingga tidak bisa memakai penyaring bakteri;

Tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa;

Tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan air;

Berat molekul (BM) antara 15.000 4.000.000; dan

Ukuran umumnya 1 50m.

Secara garis besar, pirogen dikelompokkan menjadi 2 golongan; yaitu pirogen
endogen dan pirogen eksogen.

Pirogen Endogen
yaitu faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh kita sendiri sebagai reaksi
kekebalan melawan kuman penyakit yang masuk ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL1), interleukin-6 (IL-6), alpha-interferon, dan tumor necrosis factor (TNF).

Pirogen Eksogen
yaitu faktor eksternal tubuh yang menyebabkan gangguan pada fungsi tubuh
manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan virus. Selain itu, bisa juga berupa zat
racun (toksin) yang dihasilkan oleh bakteri atau virus tertentu.
Jika suatu pirogen masuk ke tubuh, maka pirogen menjadi suatu benda asing yang
dapat menimbulkan respon imun berupa demam. Demam yaitu suatu keadaan ketika
temperatur tubuh di atas batas normal yang dapat disebabkan oleh kelainan dalam
otak sendiri atau oleh bahan bahan toksik yang mempengaruhi pusat pengaturan

temperatur. Penyebab penyebab tersebut meliputi penyakit bakteri, tumor otak,

dan keadaan lingkungan yang dapat berakhir dengan serangan panas (Suwandi,1988).
Uji pirogenitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui apakan suatu
sediaan uji bebas pirogen atau tidak, dengan maksud untuk membatasi resiko reaksi
demam yang dapat diterima oleh pasien apabila diinjeksi dengan suatu sediaan
farmasi (Suwandi, 1988).
Uji pirogenitas biasanya menggunakan kelinci. Pengujian ini ditetapkan di USP
pertama kali pada tahun 1942 dan merupakan pengujian resmi untuk menentukan
non-pirogenitas sediaan farmasi. Sejak diketahui bahwa endotoksin ternyata mampu
menggumpalkan sel darah Limulus, kemudian dikembangkan suatu pengujian untuk
mendeteksi adanya endotoksin dengan menggunakan reagensia yang dibuat dari sel
darah Limulus. Pengujian ini kemudian dikenal sebagai metodeLimulus Amebocyt
Lysate (LAL Test) (Suwandi,1988).
Uji LAL merupakan pengujian untuk memperkirakan konsentrasi endotoksin
bakteri yang mungkin ada dalam contoh bahan. Pengujian ini pada prinsipnya
merupakan koagulasi protein yang ada dalam reagensia LAL oleh endotoksin.
Pengujian tersebut ialah dinyatakan positif apabila terjadi pembentukan gel dan
dinyatakan negatip bila tidak terjadi pembentukan gel. Pembentukan gel akan
terjadi apabila kandungan endotoksin dalam contoh sediaan lebih besar daripada
sensitivitas reagen yang dinyatakan dalam Endotoksin Unit per ml (EU/ml) atau
ng/ml (Suwandi,1988).
Pemakaian metode LAL untuk pengujian berbagai bahan yang berkaitan
dengan farmasi, antara lain:
Pemeriksaan bahan baku untuk parenteral, pemeriksaan air proses untuk
parenteral,
pemeriksaan elemen filter untuk eliminasi pirogen, menentukan penyebab
terjadinya pirogen positip,
untuk validasi sterilisasi dry-heat,
pengujian produk jadi,
radiofarmasi ,
larutan untuk hemodialisis dan air untuk mengencerkan larutan hemodialisis
(pengujian tidak diperlukan secara resmi),
injeksi dengan dosis tunggal lebih besar dari 15 ml,infus
Meskipun demikian, pengujian pirogenitas menggunakan kelinci masih menjadi pilihan
utama karena:
Metode ini telah lama dikenal dan digunakan untuk menguji berbagai sediaan dan
terbukti memberikan hasil memuaskan;

Kelinci memiliki sensitivitas terhadap substansi pirogenik yang mirip dengan

manusia. Kenaikan suhu kelinci akibat substansi-pirogenik, sampai batas tertentu
masih dapat diterima oleh manusia; sehingga kenaikan suhu kelinci tersebut dapat
distandardisasi terhadap substansi pirogenik yang dapat diterima manusia. Bangham
menyebutkan, uji kelinci menggambarkan seluruh respon farmakologis terhadap
pirogen dan relevan dengan respon pada manusia;
Metode kelinci mampu mendeteksi semua pirogen termasuk endoktoksin sedangkan
LAL tidak.
Sedangkan kelemahan metode uji pirogenitas menggunakan kelinci dibandingkan
dengan LAL Test antara lain:
Memerlukan pemeliharaan dan perawatan hewan dan laboratorium yang lebih
intensif. Hewan harus dipelihara dalam ruangan dengan temperatur tidak jauh
berbeda dengan tempat percobaan. Pemeliharaan hewan harus dilakukan dengan
sebaik mungkin untuk menghindari infeksi penyakit yang dapat mengganggu
percobaan atau mengacaukan interpretasi hasil. Berat badan kelinci harus dijaga
jangan sampai mengalami penurunan yang berarti dalam 1 minggu menjelang
digunakan;
Sensitivitas dipengaruhi oleh musim, kegaduhan, kegelisahan, makanan dan lain
sebagainya. Kegelisahan akan dapat menyebabkan kenaikan suhu relatif tinggi,
sehingga mengacaukan interpretasi hasil;
Variabilitas biologis. Respon setiap kelinci terhadap substansi yang sama belum
tentu sama, sehingga terdapat variasi kenaikan suhu pada tiap kelinci.
Prinsip uji pirogenitas menggunakan kelinci adalah dengan injeksi intravena ke
tubuh kelinci di bawah kondisi tertentu dan selanjutnya dipantau dan dicatat
temperatur 3 kelinci dalam jangka waktu tertentu.
Dipirogenasi dapat dicapai dengan 2 cara,yaitu dengan dengan menginaktivasi
atau menghilangkan endotoksin. Inaktivasi dapat dilakukan dengan pemurnian
molekul lipopolisakarida denganmenggunakan sejumlah besar perlakuan kimia yang
memecah / merusak bahan kimia lain/gugus yang dibutuhkan untuk aktivasi
pirogenik. Sebagai alternatif lain molekul dapat dirusak secara total dengan
menggunakan beberapa metode yang berbeda baik berdasarkan karakteristik fisik
dan endotoksin seperti berat molekul dan muatan elektrostatik/afinitas endotoksin
pada permukaan yang berbeda.
Uji pirogen dapat ditentukan dengan beberapa cara yaitu:
Penentuan pirogen secara fisiko kimia. (kuantitatif pirogen)
1. Dengan fotokolorimetri. Reagen Tetrabrom phenolphthalein (TBP) dan
penambahan asam acetat 0,2 N, sehingga timbul warna.

2. Polarografi. Pirogen mempunyai panjang gelombang maksimum oksigen pada

polarografi.
3. Elektroforesis
4. Spektrofotmetri. Pirogen mempunyai absorbsi spektrum ultraviolet pada E
maksimum 265nm.
Penentuan pirogen secara biologis. (kualitatif dari pirogen)
1. Pengujian pengukuran temperatur badan hewan percobaan. (Rabbit Test)
2. Perhitungan sel darah putih
3. Tes limulus (LAL test)

===================================================================

BAB IV
KESIMPULAN
1. Pirogen adalah senyawa organic yang menyebabkan demam, materi penyebab demam
ini adalah lipopolisakarida dari dinding luar sel bakteri.
2. Metode pengujian pyrogen :
a. Rabbit test ( dengan menggunakan kelinci sebagai hewan coba)
b. LAL (Limulus amebocyte lysate) : pengujian dengan menggunakan reagen.
c. Pengujian dengan kuantitatif dan kualitatif
3. Depirogenasi dengan Menghilangkan Endotoksin
a. Pembilasan
b. Destilasi
c. Ultrafiltrasi
d. Osmosa bolak balik
e. Karbon aktif
f. Daya tarik elektrosatik dengan jalan modifikasi media
g. Daya tarik hidrofobik pada media hidrofobik
Read more: http://reseptor09.blogspot.com/2012/05/uji-metode-penghilanganpyrogen.html#ixzz4MmW8M0V2