TUGAS

PRAKTIKUM UJI PIROGEN

Ditujukan untuk memenuhi Tugas Mata Kuliah Farmakologi

Disusun oleh :

YONA VISTA VIANA

191FF04020

UNIVERSITAS BHAKTI KENCANA

FAKULTAS FARMASI

2020
1. Rabbit Pirogen Test
1.1. Definisi Uji Pirogen

Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi risiko reaksi demam pada tingkat
yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Pengujian
meliputi pengukunan kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan sediaan uji secara
intravena dan ditujukan untuk sediaan yang dapat ditoleransi oleh kelinci
percobaan pada dosis tidak lebih dari 10 ml/kg yang disuntikkan secara intravena
dalam periode tidak lebih dari 10 menit. Untuk sediaan yang memerlukan
penyiapan pendahuluan atau cara pemberian khusus, ikuti petunjuk tambahan yang
diberikan pada masing-masing monografi atau, dalam hal antibiotik atau sediaan
biologi petunjuk tambahan diberikan dalam ketentuan lain.

1.2. Alat dan Pengencer

Alat suntik, jarum dan alat gelas dibebaskan dari pirogen dengan pemanasan
pada 250°C selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan metode lain yang
sesuai. Perlakukan semua pengencer dan larutan untuk mencuci dan peralatan atau
alat suntik parenteral sedemikian rupa yang dapat menjamin alat tersebut steril dan
bebas pirogen. Lakukan uji pirogen pada pengencer dan larutan untuk pencuci atau
pembilas alat secara berkala. Bila digunakan Injeksi Natrium Klorida sebagai
pengencer, gunakan larutan yang mengandung natrium klorida 0,9%.

1.3. Rekaman Suhu

Gunakan alat pendeteksi suhu yang teliti seperti thermometer klinik atau alat
termistor atau alat sejenis yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian ± 0,1
dan telah diuji untuk penetapan bahwa pembacaan maksimum dapat dicapai kurang
dari 5 menit. Masukkan alat pendeteksi suhu ke dalam rektum kelinci uji dengan
kedalaman tidak kurang dari 7,5 cm dan setelah periode waktu tidak kurang dari
yang ditetapkan sebelumnya, catat suhu tubuh kelinci.

1.4. Hewan Uji

Gunakan kelinci dewasa yang sehat. Tempatkan kelinci satu ekor dalam satu
kandang dalam ruangan dengan suhu yang seragam antara 20°C - 23°C dan bebas
dari gangguan yang menimbuilcan kegelisahan. Perbedaan suhu tidak lebih dari ±
3°C dari suhu yang ditetapkan. Kelinci yang belum pemah digunakan untuk uji
 pirogen, adaptasikan kelinci tidak lebih dad tujuh had dengan uji pendahuluan
yang meliputi semua tahap yang tertera pada Prosedur, kecuali penyuntikan.
Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu 48
jam, atau sebelum 2 minggu untuk uji pirogen yang menunjukkan kenaikan suhu
0,6°C atau lebih, atau telah digunakan untuk uji sediaan yang dinyatakan
pirogenik.

1.5. PROSEDUR

Lakukan uji dalam ruang terpisah yang dirancang untuk pengujian pirogen dan
pada kondisi lingkungan yang sama dengan ruang pemeliharaan hewan dan bebas
dan gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Kelinci tidak diberi makan selama
pengujian. Boleh diberi minum setiap saat, tetapi terbatas. Jika termistor
pengukur suhu rektum digunakan untuk pengujian, kelinci diletakkan dalam
penyekap yang dapat menahan kelinci dengan leher yang longgar sehingga dapat
duduk dengan bebas. Tetapkan suhu kontrol dad tiap kelinci tidak lebih dari 30
menit sebelum penyuntikan larutan uji. Suhu tersebut digunakan sebagai awal
untuk penetapan setiap kenaikan suhu yang dihasilkan dan penyuntikan larutan
uji. Dalam setiap kelompok kelinci uji, gunakan kelinci yang mempunyai
perbedaan suhu kontrol antara satu dengan lainnya tidak lebih dari 1 oC, dan suhu
kontrol setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39,8°C. Kecuali dinyatakan lain pada
masing-masing monografi, suntikkan 10 ml larutan uji per kg berat badan
kedalam vena telinga setiap tiga kelinci, lakukan penyuntikan dalam waktu 10
menit. Larutan uji berupa sediaan yang perlu dikonstitusi sesuai etiket, atau bahan
uji yang diperlakukan seperti tertera pada masing-masing monografi dan
disuntikkan sesuai dosis tersebut. Untuk uji pirogen dari alat atau perangkat
injeksi, gunakan cucian atau bilasan permukaan yang kontak dengan bahan yang
diberikan secara parenteral, tempat penyuntikan atau janingan tubuh pasien.
Semua larutan uji hanis terjamin bebas kontaminasi. Lakukan penyuntikan setelah
larutan uji dihangatkan pada suhu 37o ± 2o C . Rekam suhu berturut-turut antara
jam ke-1 dan ke-3 setelah penyuntikan dengan selang waktu 30 menit.

1.6. Interpretasi Hasil dan Lanjutan

Setiap penurunan suhu dianggap nol. Sediaan memenuhi syarat apabila tidak
ada satupun kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5° C atau lebih. Bila ada
 kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5°C atau lebih, lanjutkan uji
menggunakan lima ekor kelinci lain. Sediaan memenuhi syarat bebas pirogen
bila, tidak lebih dari 3 dari 8 ekor masing-masing menunjukkan kenaikan suhu
0,5°C atau lebih dan jumlah kenaikan suhu maksimum 8 kelinci tidak melebihi
3,3o C.

2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL)

2.1. Definisi Uji Enterotoksin
Uji endotoksin bakteri adalah uji untuk mendeteksi atau mengkuantitasi
endotoksin bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel yang diuji. Pengujian
dilakukan menggunakan Limulus Amebocyte Lysate (LAL) yang diperoleh dari
ekstrak air amebosit dalam kepiting ladam kuda (Limulus polyphemus atau
Tachypleus tridentatus) dan dibuat khusus sebagai pereaksi LAL. Terdapat dua
tipe teknik uji, teknik pembentukan jendal gel dan teknik fotometnik. Teknik
fotometrik mencakup metode turbidimetni, yang didasarkan pada pembentukan
kekeruhan setelah penguraian substrat endogen, dan metode kromogenik yang
didasarkan pada pembentukan warna setelah terjadi penguraian kompleks
kromogen-peptida sintetik. Lakukan salah satu dari teknik tersebut, kecuali jika
dinyatakan lain dalam monografi. Jika terjadi keraguan, maka keputusan akhir
didasarkan pada hasil Teknik Pembentukan Jendal Gel, kecuali dinyatakan lain
dalam monografi.
Pada Teknik Pembentukan Jendal Gel, penetapan titik akhir reaksi dilakukan
dengan membandingkan langsung enceran dan zat uji dengan enceran endotoksin
baku, dan jumlah endotoksin dinyatakan dalam Unit Endotoksin (UE). Pereaksi
LAL diformulasikan juga untuk digunakan dalam pengujian turbidimetri dan
kolorimetni, maka pengujian-pengujian tersebut dapat digunakan untuk
memenuhi persyaratan yang ditetapkan. Kedua uji inii memerlukan pembuatan
kurva regresi baku dan kandungan endotoksin dari zat uji ditetapkan dengan
interpolasi dari kunva tersebut. Prosedur meliputi inkubasi selama waktu yang
telah ditetapkan dari endotoksin yang bereaksi dan larutan kontrol dengan
pereaksi LAL, dan pembacaan serapan cahaya pada panjang gelombang yang
sesuai. Pengukuran titik akhir pada prosedur secara turbidimetri, pembacaan
dilakukan segera pada akhir masa inkubasi. Pengukuran titik akhir pada prosedur
secara kolonimetni, reaksi dihentikan pada akhir dan waktu yang telah ditetapkan,
 dengan penambahan zat pemutus-neaksi-enzim, sebelum pengukuran. Pada
penetapan kadar secara kinetik (turbidimetri dan kolonimetri), serapan diukur
selama periode reaksi dan dari pengukunan tersebut ditetapkan nilai kecepatan
reaksi.
2.2. Alat dan Alat Gelas
Depirogenasi seluruh peralatan gelas dan bahan tahan panas lainnya dalam
oven udara panas menggunakan proses yang telah diva1idasi. Umumnya waktu
dan suhu minimum yang digunakan adalah 30 menit pada 250˚C. Jika
menggunakan Peralatan plastik, misalnya microplate dan pipet tips untuk pipet
otomatis, gunakan hanya yang sudah dibuktikan bebas endotoksin dan tidak akan
mengganggu pengujian. [Catatan: Pada bagian mi, istilah tabung dimaksudkan
untuk semua wadah, misalnya sumur mikroliter.]
1) Pereaksi LAL bereaksi dengan beberapa β-glukan bila ditambahkan pada
endotoksin. Beberapa sediaan yang diperlakukan tidak bereaksi dengan β-
glukan dan hams digunakan untuk contoh yang mengandung glukan.
2) Prosedur untuk uji validasi inaktivasi endotoksin, lihat Sterilisasi Pemanasan
Kering dalam Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas untuk Bahan Kompendial.
Gunakan pereaksi LAL dengan sensitivitas tidak kurang dari 0,15 UE per ml.

2.3. Penyiapan Larutan Induk Baku Pembanding dan Larutan Baku

Pembanding Endotoksin
Baku pembanding endotoksin (BPE) adalah Endotoksin BPFJ yang telah
diketahui potensinya dalam UE per vial. Konstitusi seluruh isi vial BPE dengan
5,0 ml air pereaksi LAL. [Catatan Air pereaksi LAL adalah air untuk injeksi atau
air lain yang tidak bereaksi dengan pereaksi LAL yang digunakan pada batas
kepekaan pereaksi.] Campur dengan pengocok vorteks secara intermiten selama
30 menit. Gunakan larutan pekat mi untuk membuat seri pengenceran yang
sesuai. Simpan larutan pekat dalam lemari pendingin, selama tidak lebih dan 14
hari untuk membuat pengenceran berikutnya. Sebelum digunakan kocok kuat
dengan pengocok vorteks selama tidak kurang dari 3 menit. Campur setiap
enceran tidak kurang dari 30 detik sebelum membuat pengenceran berikutnya.
Enceran tidak boleh disimpan karena menyebabkan hilangnya aktivitas oleh
penyerapan, kecuali ada data penunjang tentang hal ini.
2.4. Uji Persiapan

Gunakan Pereaksi LAL yang sudah ditetapkan kepekaannya sesuai dengan

yang tertera pada etiket. Keabsahan hasil uji untuk endotoksin bakteri ini
memerlukan pembuktian yang cukup bahwa contoh bahan atau larutan, pencuci,
atau ekstrak yang digunakan pada uji, tidak menghambat atau memacu reaksi atau
dapat mengganggu pengujian dengan cara apapun. Validasi dilakukan dengan Uji
penghambatan atau pemacuan sebagaimana yang diuraikan pada 3 teknik yang
telah disebutkan sebelumnya. Dalam uji mi harus dimasukkan kontrol negatif
yang sesuai. Validasi harus diulang jika sumber Pereaksi LAL atau metode
pembuatan atau formulasi bahan berubah.

2.5. Penyiapan Larutan Uji

Siapkan larutan uji dengan melarutkan atau mengencerkan obat, atau

mengekstraksi alat kesehatan dengan Air Pereaksi LAL. Beberapa bahan atau
sediaan mungkin lebih baik dilarutkan, diencerkan atau diekstraksi dalam larutan
mengandung air lainnya. Jika perlu, atur pH larutan (atau hasil pengencerannya)
yang akan diuji hingga pH campuran pereaksi LAL dan larutan uji terletak pada
rentang pH yang ditentukan oleh produsen pereaksi LAL. Hal mi biasanya
digunakan pada produk dengan rentang pH 6,0-8,0. Pengaturan pH dapat
dilakukan dengan menggunakan asam, basa atau larutan dapar yang sesuai
dengan rekomendasi produsen pereaksi LAL. Asam dan basa dapat dibuat dan
konsentrat atau padatan dengan Air Pereaksi LAL dalam wadah bebas
endotoksin. Larutan dapar hams divalidasi bebas endotoksin dan faktor
pengganggu.

2.6. Penetapan Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA)

Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA) adalah pengenceran maksimum
yang diperbolehkan dari suatu contoh agar batas endotoksinnya dapat ditetapkan.
Pengenceran Maksimum yang Absah diberlakukan untuk injeksi atau larutan
parenteral terkonstitusi atau diencerkan, atau jika diperlukan, untuk jumlah obat
 dalam bobot jika volume obat yang diberikan bervariasi. Persamaan umum untuk
menentukan PMA adalah:
PMA = (batas endotoksin x konsentrasi larutan sampel)/λ
λ adalah kepekaan Pereaksi LAL yang tertera pada etiket (UE/mL).

Hubungan konsentnasi larutan sampel dan X dijelaskan di bawah ini:

- Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan dalam konsentrasi
(UE/mL), maka PMA dapat dihitung dengan rumus: PMA = batas endotoksin
(UE/mL)/λ
- Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan dalam UE/mg atau
UE/Unit, maka PMA dapat dihitung dengan rumus umum tersebut di atas,
PMA = (batas endotoksin x konsentrasi sampel)/λ

PMA yang diperoleh adalah batas pengeceran yang diperbolehkan untuk uji yang
absah. Konsentrasi sampel dengan satuan (mg/mL atau Unit/mL)

2.7. Penetapan Batas Endotoksin

Batas endotoksin obat parenteral, ditetapkan berdasarkan dosis, sama dengan

K/M. K adalah dosis ambang pirogenik endotoksin pada manusia per kg berat
badan, dan M sama dengan dosis maksimum produk pada manusia per kg berat
badan dalam periode satu jam. Dalam masing-masing monografi, batas
endotoksin obat parenteral dinyatakan dalam unit, misalnya UE/ml, UE/mg atau
UE/unit aktivitas biologi.

1) Air steril untuk injeksi atau air lain yang tidak menunjukkan reaksi spesifik
dengan pereaksi LAL yang akan digunakan, pada batas sensitivitas
pereaksi.
2) K adalah 5 UE per kg untuk semua cara pemberian selain dari intratekal (K
adalah 0,2 UE per kg berat badan). Untuk sediaan radiofarmaka yang tidak
diberikan secara intratekal, batas endotoksin dihitung sebagai 175/V, V
adalah dosis maksimum dalam ml yang direkomendasikan. Untuk sediaan
radiofarmaka yang diberikan secara intratekal. Batas endotoksin ditetapkan
dengan rumus 14/V. Untuk formulasi (biasanya produk antikanker)
 diberikan berdasarkan pada m2 luas permukaan tubuh, dengan rumus K/M,
K= 5 UE per kg dan M adalah (dosis maksimum/m2/jam x 1,80 m2)/ 70 kg.

2.8. Metode
2.8.1. Cara Jendal Gel

Cara jendal gel mendeteksi atau mengkuantitasi endotoksin berdasarkan

pembentukan jendal dan pereaksi LAL dengan adanya endotoksin. Konsentrasi
endotoksin yang dibutuhkan untuk menyebabkan lysate menjendal pada kondisi
standar dinyatakan sebagai kepekaan pereaksi LAL yang tertera pada etiket.
Untuk menjamin presisi dan keabsahan pengujian, lakukan uji konfirmasi
kepekaan pereaksi LAL yang tercantum dalam etiket dan uji faktor pengganggu
seperti tertera dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel.

2.8.1.1. Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel

Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL Lakukan konfirmasi kepekaan

pereaksi yang tertera pada etiket menggunakan tidak kurang dan 1 vial untuk
setiap lot pereaksi LAL. Buat pengenceran seri kelipatan 2 dan BPE dalam Air
Pereaksi LAL hingga konsentrasi 2λ; λ; 0,5λ; dan 0,25λ adalah kepekaan pereaksi
LAL yang tertera pada etiket (UE/mL). Lakukan uji pada 4 konsentrasi larutan
baku, dalam 4 replikasi termasuk kontrol negatif. Uji konfirmasi kepekaan lysate
dilakukan bila menggunakan pereaksi LAL batch baru atau bila ada perubahan
dalam kondisi uji yang dapat mempengaruhi hasil uji.

Campur pereaksi LAL dengan larutan baku dan masing-masing konsentrasi

dalam tabung uji dengan volume yang sama (0,1 ml). Jika digunakan vial atau
ampul uji tunggal berisi pereaksi LAL kering beku, tambabkan larutan langsung
ke dalam vial atau ampul. Inkubasi campuran reaksi dalam waktu yang tetap
sesuai dengan petunjuk produsen pereaksi LAL (biasanya 37°±1°C, selama 60±2
menit), hindari getaran. Untuk menguji integnitas gel, ambil setiap tabung
langsung dan inkubator dan balikkan 180˚C secara perlahan-lahan. Jika telah
terbentuk gel yang kuat, yang tetap di tempatnya walaupun telah dibalik, catat
sebagai hasil positif. Jika gel tidak terbentuk atau gel yang terbentuk jatuh ketika
dibalik, maka hasil dinyatakan negatif. Uji dinyatakan absah, jika larutan baku
konsentrasi terendah memberikan hasil negatif pada semua replikasi uji.
 Titik akhir adalah konsentrasi terendah yang masih memberikan hasil positif
dari satu pengenceran sen. Hitung nilai rata-rata dari logaritma konsentrasi titik
akhir, е, dan hitung antilogaritma dari nilai rata-rata menggunakan rumus berikut:
Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir = antilog ∑(elf). ∑e adalah jumlah
logaritma konsentrasi titik akhir dan pengenceran seri yang digunakan; dan f
adalah jumlah replikasi. Rata-rata geometri konsentrasi titik akhir adalah hasil
pengukuran kepekaan pereaksi LAL (UE/ml). Jika hasil pengukuran kepekaan
tidak kurang dari 0,5λ dan tidak lebih dari 2λ, maka kepekaan yang tercantum di
etiket sesuai dan dapat digunakan dalam pelaksanaan pengujian dengan lysate.

2.8.1.2. Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal Gel.

Siapkan larutan A, B, C, dan D seperti tertera pada Tabel 1 dan lakukan uji
penghambatan atau pemacuan pada larutan sampel yang diencerkan kurang dani
PMA, tidak mengandung endotoksin, dan ikuti prosedur dalam Uji Konfirmasi
Kepekaan Pereaksi LAL Rata-rata geometnik konsentrasi titik akhir dan larutan B
dan C, ditetapkan dengan menggunakan persamaan uji di atas.
Uji ini harus diulang apabila terjadi perubahan kondisi yang dapat
mempengaruhi hasil uji. Uji dinyatakan absah apabila larutan A dan D
membenikan hasil negatif, dan hasil larutan C sesuai dengan kepekaan yang
tertera pada etiket.
Jika kepekaan lysate yang diperoleh dalam larutan uji pada larutan B tidak
kurang dari 0,5λ dan tidak lebih dan 2λ, maka larutan uji tidak mengandung
faktor pengganggu pada kondisi uji yang digunakan. Jika sebaliknya, berarti
terdapat faktor penggangu. Jika sampel yang diuji tidak memberikan basil yang
sesuai pada pengenceran yang digunakan, ulangi uji menggunakan pengenceran
yang lebih besan, tetapi tidak boleh melebihi PMA. Bila digunakan lysate yang
lebih peka, maka pengenceran sampel lebih besar, dan dalam hal mi dapat
mengurangi pengganggu. Gangguan dapat diatasi dengan penanganan yang sesuai
misalnya penyaningan, netralisasi, dialisis, atau pemanasan. Untuk memastikan
bahwa penanganan yang dipilih efektif menghilangkan gangguan tanpa
menghilangkan endotoksin, lakukan pengujian di bawah mi menggunakan
sediaan uji dengan penambahan BPE sesuai dengan perlakuan yang dipilih.

2.8.1.3. Uji Batas Jendal Gel

Uji ini dilakukan bila dalam monografi disebutkan batas endotoksin.

Prosedur Siapkan larutan A, B, C dan D seperti tertera pada Tabel 2 dan

lakukan pengujian larutan mi mengikuti prosedur Uji Konfirmasi Kepekaan
Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal Gel.

Interpretasi Uji absah jika kedua replikasi kontrol positif larutan B dan C
memberikan basil positif dan kedua kontrol negatif larutan D adalah negatif.
Sediaan uji memenuhi syarat jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung
reaksi yang berisi larutan A, dan tidak memenuhi syarat jika diperoleh hasil
positif pada dua tabung.

Ulangi pengujian jika diperoleh hasil positif pada satu tabung reaksi berisi
larutan A dan hasil negative pada tabung lainnya. Sediaan uji memenuhi syarat
jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung reaksi pada pengujian ulang. Jika
pengujian positif untuk sediaan uji dengan pengenceran lebih kecil dari PMA,
pengujian dapat diulang dengan pengenceran tidak melebihi PMA.
2.8.1.4. Penetapan Kadar Endotoksin Bakteri dengan Cara Jendal Gel

Penetapan kadar ini menghitung jumlah endotoksin bakteri dalam larutan

sampel dengan cara titrasi hingga titik akhir. Prosedur Siapkan larutan A,B,C dan
D seperti tertera pada Tabel 3 dan uji larutan ini mengikuti prosedur Uji
Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, tertera dalam Uji Persiapan untuk Cara
Jendal Gel.

Perhitungan dan Interpretasi Uji absah jika kondisi berikut dipenuhi:

1) Kedua replikasi dari kontrol negatif larutan D adalah negatif;

2) Kedua replikasi dari kontrol positif larutan B adalah positif;
3) Rata-rata geometrik kadar titik akhir larutan C berada dalam rentang 0,5λ-
2λ..
Untuk menentukan kadar endotoksin dalam larutan A, hitung kadar titik akhir
setiap seri replikasi dan pengenceran dengan mengalikan tiap faktor pengenceran
titik akhir dengan λ. Kadar endotoksin dalam sampel adalah rata-rata geometrik
kadar titik akhir replikasi (lihat rumus yang diberikan dalam Uji Konfirmasi
Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal
Gel). Jika pengujian dilakukan dengan mengencerkan larutan sampel, hitung
kadar endotoksin dalam sampel awal dengan mengalikannya dengan faktor
pengenceran. Jika tidak ada pengenceran sampel yang positif dalam pengujian
absah, laporkan kadar endotoksin kurang dari λ (jika enceran sampel yang diuji
 kurang dari 2. dikalikan faktor pengenceran terkecil dari sampel). Jika semua
pengenceran positif, kadar endotoksin dilaporkan sama atau lebih besar dari
faktor pengenceran terbesar dikalikanλ. (Misalnya: Faktor pengenceran awal 8
kali 2. pada Tabel 3). Bahan memenuhi syarat jika kadar endotoksin kurang dari
nilai yang dinyatakan dalam masing-masing monografi.

2.8.2. Cara Fotometrik

Metode turbidimetri mengukur peningkatan kekeruhan. Berdasarkan prinsip

pengujian yang digunakan, teknik mi dikiasifikasikan menjadi turbidimetni titik
akhir dan turbidimetri kinetik. Cara turbidimetri titik akhir didasarkan pada
hubungan kuantitatif antara kadar endotoksin dan kekeruhan (serapan atau
transmisi) dari campuran reaksi pada akhir masa inkubasi. Cara turbidimetri
kinetik dapat dilakukan dengan dua cara: mengukur waktu yang dibutuhkan untuk
mencapai nilai serapan yang telah ditetapkan atau kecepatan pembentukan
kekeruhan.

Metode kromogenik mengukur kromofor yang dilepaskan dari peptida

kromogenik yang sesuai, yang dihasilkan dari reaksi antara endotoksin dengan
pereaksi LAL. Berdasarkan prinsip pengujian yang digunakan, teknik ini
diklasifikasikan sebagai teknik kromogenik titik akhir atau kromogenik kinetik
Cara kromogenik titik akhir didasarkan pada hubungan kuantitatif antara kadar
endotoksin dan pelepasan kromofor pada akhir masa inkubasi. Cara kromogenik
kinetik dapat dilakukan dengan mengukur waktu yang dibutuhkan untuk
mencapai nilai serapan yang telah ditentukan atau kecepatan pembentukan
warnaa. Seluruh pengujian fotometrik dilakukan pada suhu inkubasi yang
direkomendasikan oleh produsen Pereaksi LAL, umumnya 37°±1°C.

2.8.2.1. Persiapan Cara Fotometrik

Untuk menjamin presisi atau keabsahan dan cara turbidimetri dan kromogenik
dilakukan uji persiapan untuk memfenifikasi kritenia kurva baku yang absah dan
 lanitan sampel tidak menghambat atau memacu reaksi. Revalidasi metode
pengujian diperlukan bila terjadi perubahan kondisi yang dapat berpengaruh
terhadap hasil uji.

Verifikasi Kriteria Kurva Baku Dengan menggunakan larutan endotoksin

baku, siapkan minimal 3 kadar endotoksin untuk membuat kurva baku. Lakukan
pengujian menggunakan minimal 3 replikasi untuk masing-masing kadar
endotoksin baku, sesuai instruksi produsen pereaksi LAL (perbandingan volume,
waktu inkubasi, suhu, pH, dan lain-lain). Jika rentang yang diinginkan dalam
metode kinetik lebih besar dari 2 log, maka harus dimasukkan larutan baku
tambahan, agar setiap kenaikan log tetap berada dalam rentang kurva baku. Nilai
absolut dari koefisien korelasi, | r | harus lebih besan atau sama dengan 0,980
untuk nentang kadar endotoksin sebagaimana ditetapkan oleh produsen peneaksi
LAL.

2.8.2.2. Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik

Pilih satu kadar endotoksin pada atau di sekitar pentengahan kunva baku
endotoksin. Siapkan larutan A, B, C dan D seperti tertera pada Tabel 4. Lakukan
uji terhadap larutan A, B, C dan D minimal duplo sesuai instruksi untuk Peneaksi
LAL yang digunakan (volume sampel dan peneaksi LAL, perbandingan volume
sampel dengan peneaksi LAL, waktu inkubasi, dan lain-lain). Rata-rata perolehan
kembali endotoksin yang ditambahkan adalah kadar endotoksin total dalam
larutan dikurangi kadar endotoksin dalam larutan semula (jika ada). Agar dapat
dinyatakan bebas dari faktor pengganggu pada kondisi pengujian, hasil
pengukuran kadar endotoksin yang ditambahkan pada sampel harus berada
diantara 50-200% dari kadar endotoksin yang ditambahkan. Bila perolehan
kembali endotoksin benada di luar rentang yang ditetapkan maka faktor
pangganggu harus dihilangkan dengan melakukan Uji Faktor Pengganggu untuk
Cara Jendal Gel sebagaimana yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal
Gel. Ulangi Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal Gel untuk memvalidasi
perlakuan.

2.8.2.3. Prosedur Cara Fotometrik

Lakukan prosedur seperti tertera pada Uji Faktor Pengganggu untuk Cara
Fotometrik dalam Uji Persiapan Cara Fotometrik.
2.8.2.4. Perhitungan Untuk Cara Fotometrik

Hitung kadar endotoksin dari tiap-tiap replikasi larutan uji A, menggunakan

kurva baku yang dibuat dengan kontrol positif larutan C. Uji dinyatakan absah
jika kondisi berikut dipenuhi:

1) Hasil kontrol positif larutan C memenuhi persyaratan validasi yang

ditetapkan pada Verifikasi Kriteria Kurva Baku dalam Uji Persiapan Cara
Fotometrik;
2) Perolehan kembali endotoksin, dihitung dari konsentrasi endotoksin
larutan B setelah dikurangi konsentrasi endotoksin larutan A, berada pada
rentang 50% - 200%; dan
3) Hasil kontrol negatif larutan D tidak melebihi batas nilai blangko yang
dipersyaratkan dalam uraian pereaksi LAL yang digunakan.

2.8.2.5. Penafsiran Hasil Cara Fotometrik

Pada penetapan kadar secara fotometrik, sediaan uji memenuhi syarat jika rata-
rata kadar endotoksin dan replikasi larutan A, setelah koreksi pengenceran dan
kadar, lebih kecil dari batas endotoksin produk.
Sumber:

Depkes, RI. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V Jilid II, 1406-1411 . Jakarta:
Departemen Kesehatan RI.