PIROGEN

Lucia Hendriati
Teguh Widodo
PENDAHULUAN
• Biliroth (abad 19) mencatat pasien setelah
disuntik timbul demam.
• Diperkirakan zat penimbul demam adalah
zat/obat yang digunakan untuk pengobatan.
• Pasien yang disuntik dengan air suling steril

PIROGEN
juga timbul demam
• Tahun 1912, Holt dan Pentfold mengidentifikasi
pirogen sebagai penyebab demam
Endotoksin dan pirogen
• Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh
bakteri gram negatif
• Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan
kenaikan suhu Tubuh akibat penggunaan produk
farmasi yang diberikan secara intravena
• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak

PIROGEN
semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
• Endotoksin bakteri terdiri dari
Lipopolisakarida(LPS), umumnya terikat pada
protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran
luar bakteri gram negatif.
EFEK ENDOTOKSIN
•demam
•aktivasi sistem sitokin
•rusaknya sel-sel endotelial
•permeabilitas pembuluh darah berubah sehingga
menyebabkan turunnya tekanan darah

PIROGEN
Pirogen
• Pirogen adalah suatu lemak atau lipid yang
kadang-kadang mengandung fosfor dan terikat
pada suatu polisakarida atau protein atau
kedua-duanya
• Pirogen merupakan suatu protein dengan BM
10.000-20.000 Daltons yang dilepaskan oleh

PIROGEN
beberapa jenis sel tertentu didalam tubuh
• Pirogen terdiri dari polisakarida bakteri
• Pirogen merupakan senyawa nitrogen dan
biasanya terdiri dari kuman yang mati, hancur,
endotoksin dan eksotoksin.
Sifat fisika kimia pirogen
• Larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut-
pelarut organik
• BM tinggi
• Termostabil, terutama dalam larutan
• Tidak menguap, tetapi destilasi biasa tidak
menyingkirkan pirogen

PIROGEN
• Dapat difiltrasi
Endotoksin
• Adalah suatu zat yang berasal dari bakteri
gram negatif, mempunyai struktur kimia
berupa kompleks lipopolisakarida yang
terdapat pada dinding sel bakteri dan
dilepaskan bila bakteri mengalami lisis
• Tahan terhadap pemanasan

PIROGEN
• Mempunyai BM 100.000-900.000
• Bakteri gram positif tidak menghasilkan
endotoksin
Catatan:
• Zat yang mempunyai struktur yang sama
dengan pirogen atau endotoksin dan tidak
menimbulkan reaksi demam BUKAN pirogen

PIROGEN
SUMBER PIROGEN

• dari tubuh manusia atau

Pirogen hewan sendiri seperti monosit
endogen atau limfosit yang dapat
diaktifkan melalui mekanisme
antigen, rx antigen-antibodi

PIROGEN
Pirogen • berasal dari mikroba hidup atau
mati seperti virus, bakteri
eksogen
• Lepasnya LPS dari bakteri gram negative dapat
terjadi setelah proses sterilisasi dan terjadi proses
lysis pada bakteri gram negative
• Bakteri gram negative yang sering memproduksi
LPS adalah Escherichia coli (E.
Coli), Proteus, Pseudomonas, Enterobacter,
dan Klebsiella

PIROGEN
• Selama sepsis gram negative, endotoksin
menstimulasi makrofag untuk melepaskan sitokin
dan radang yang berlebih menyebabkan kegagalan
banyak organ menyebabkan dan kematian
Intensitas efek pirogen
• Berasal dari satu individu ke individu lainnya
dan bahkan satu individu dengan waktu yang
berlainan.

PIROGEN
Faktor yang dapat mempengaruhi kepekaan terhadap
pirogen
• Kecepatan sirkulasi darah
• Kepekaan reseptor
• Adanya zat-zat antagonis dan agonis
• Semua faktor penting dalam pengaturan suhu

PIROGEN
tubuh
Struktur membran sel
bakteri gram negatif

PIROGEN
Sumber pirogen
• Air yang digunakan sebagai solven
• Wadah/alat yang dipakai untuk
pembuatan,pengemasan, penyimpanan atau
penggunaan
• Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk
membuat larutan parentral

PIROGEN
Depirogenasi
• Depirogenasi dibagi 2 yaitu inaktivasi dan
removal

PIROGEN
Depirogenasi ( removal )
1. Pengenceran ( pencucian/pembilasan material
seperti peralatan gelas sampai endotoksinnya
terencerkan sehingga tidak bersifat pirogen )
2. Ultrafiltrasi ( pemisahan molekul 1500-20.000
Daltons )
3. Reverse osmose ( desalinasi dan pemurnian air )

PIROGEN
4. Charge-modified media & electrostatic attraction
( PH > 2 endotoksin membentuk agregat yang
bermuatan negatif (anion), sedangkan asbes pd
pH < 8,3 bermuatan positif sehingga pirogen
diabsorbsi pada permukaan asbes.
Lanjutan …
5. Destilasi (air dipanaskan mudah menguap,
sedangkan pirogen tidak karena BM nya tinggi
 terjadi pemisahan)
6. Karbon aktif (punya afinitas yg tinggi pd
substansi yg mempunyai BM besar dan tidak
terionisasi sehingga endotoksin diabsorbsi

PIROGEN
secara fisika pada permukaan karbon aktif)
PERHATIAN:
Hati-hati untuk bahan aktif dosis kecil
2. Inaktivasi Endotoksin
a. Panas Kering
Oven ≥ 250 oC selama ≥ 30 menit
Oven 170-180 oC selama 4 jam
Efektif untuk alat-alat gelas dan logam tapi tidak
efektif untuk larutan

PIROGEN
b. Panas basah
Perlu bahan kimia untuk merusak pirogen,
misalnya: asam, basa an H2O2, sterilisasi suhu
121oC selama 180 menit
Lanjutan
c. Oksidasi
Salmonella thyposa kehilangan kapasitas penghasil
demam setelah dicuci H2O2.
d. Alkilasi/asetilasi
Bahan pengakilasi dapat menurunkan aktivitas

PIROGEN
pirogen
Contoh: - asam asetat anhidrat
- asam suksinat anhidrat
- phthalat anhidrat
- EOG
Lanjutan
e. Radiasi Ion
Toksisitas endotoksin bakteri setelah
disinari ion cobalt 60 terjadi efek letal

PIROGEN
Uji Endotoksin
• Tujuan :
Membatasi resiko reaksi demam pd tingkat yg
dapat diterima oleh pasien pada pemberian
sediaan injeksi

PIROGEN
Sediaan apa saja yg
perlu di uji
endotoksin ?

PIROGEN
• Sediaan dosis tunggal dlm wadah > 10 ml dengan
pelarut air dan akan digunakan secara i.v.
• Beberapa senyawa imunosera
• Beberapa senyawa radiofarmasi

PIROGEN
• Sediaan antibiotika dan bahan antibiotika yang
akan/dapat digunakan secara parenteral
Metode uji Pirogen
1. Biologi (in vivo)/ Rabbit Pirogen Test
2. LAL (Limulus Amebocyte Lysat)
3. MAT (Monocyte Activation test)

PIROGEN
Rabbit Test
• Seleksi hewan (sehat, dewasa bb tdk krg dari 1,5
kg)
• Pemeliharaan hewan (kondisi pemeliharaan)
• Peralatan dan bahan yg digunakan (glassware,
syringes, needles)
• Boks hewan (senyaman mungkin bg hewan)

PIROGEN
• Termometer yg dipakai 0,1° dan dpt memasuki
dubur kelinci ±5 cm
• Pengujian dengan cara peningkatan suhu tubuh
kelinci sehat setelah injeksi i.v. dari lar. steril
 PIROGEN
-Electronic thermal recording instruments used to monitor rabbit body temperatures during the pyrogen test.
-Housing of pyrogen test rabbits in clean, individual cages.
 PIROGEN
-Rabbits situated in individual restraining boxes.
-Rear view of rabbits in restraining boxes.
-Injection of pyrogen test sample into ear vein of rabbit.
Cara Pengujian
Pengujian Pendahuluan
• 1-3 hari sblm pengujian, suntikan secara i.v. 10
ml/kgBB dgn larutan NaCl P steril dan bebas
pirogen
• Catat suhu interval tdk lbh dari 30 menit dimulai
90 menit sblm penyuntikan hingga 3 jam

PIROGEN
• Kelinci tdk dpt digunakan, bila :
-beda suhu > 0,6°C
-beda suhu tiap kelinci dlm klmpok > 1°C
- Suhu awal kelinci ≥ 39,8°C
Skema pengujian pirogen

PIROGEN
Lanjutan…
Pengujian Utama
• Kelompok terdiri dari 3 ekor kelinci
• Prosedur preparasi dan penginjeksian
-hangatkan produk
-dilarutkan dan diencerkan

PIROGEN
-durasi injeksi tdk lbh dari 4 menit
-volume yg diinjeksikan tdk krg dari 0,5 ml/kg
dan tidak lbh dari 10 ml/kgBB
Kelebihan
• Kelinci mempunyai respon terhadap demam
mendekati respon manusia
• Dapat mendeteksi semua pirogen, walaupun
bukan endotoksin, seperti virus, parasit ,dll

PIROGEN
Kekurangan
• Mahal, lebih banyak memerlukan tempat,
personil dan waktu.
• Terpengaruh oleh musim, hari, keributan,
tekanan lingkungan dan makanan serta
perlakuan
• Tidak dapat digunakan utk preparat yg dpt

PIROGEN
menimbulkan hipertemi dan hipotemi, seperti :
a. Narkotika
b. hormon
c. sediaan radiofarmaka
LAL Test
• Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro
untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri
• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik
gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik
(kolorimetri)

PIROGEN
Mengapa LAL Test ?

• Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah

metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test
yang difokuskan pada deteksi senyawa
pirogen dalam produk, untuk menghindari
penggunaan hewan/binatang dalam

PIROGEN
percobaan
• Metode lebih akurat
Limulus amobacyte lysate
• Lisat diperoleh dari amubosit kepiting ladam kuda
(Limulus polyphemus)
• Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal
dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri
gram negatif pada Limulus polyphemus

PIROGEN
menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah
• Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan
bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara
endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam
amubosit.
Lanjutan…

• Solum (1970, 1973) dan Young (1972),

melakukan pemurnian dan karaterisasi protein
yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan
menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin
merupakan reaksi enzimatik

PIROGEN
Limulus polyphemus (horseshoe crab)

PIROGEN
Prinsip LAL Test
• Dasar : respon imun dari kepiting ladam kuda terhadap
invasi bakteri gram negatif.
• Bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting ladam
kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-
ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi
• Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim

PIROGEN
dalam lisat amubosit Limulus.
• Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi
endotoksin
Lanjutan…

• Enzim yang diaktivasi (enzim koagulase)

menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu
protein penggumpal (koagulogen) yang juga
terdapat pada lisat amubosit Limulus
menghasilkan koagulin.

PIROGEN
• Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan
bergabung dengan sendirinya dan
membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti
gel
Reagen LAL
• Perdarahan crabs dewasa ditampung dalam antibekuan
darah
• Dicuci dan disentrifus untuk mengumpulkan amebocyte
• Dicuci dalam NaCl 3%
• lysate di-lyophilisasi untuk penyimpanan

PIROGEN
https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/ID/en/gel-clot-lal-assay
Pengujian
• Hindari kontaminasi endotoksin
• Sebelum pengujian:
– Faktor yang menginterferensi tidak boleh ada
– Peralatan harus bebas pirogen
– Sensitivitas lysate harus diketahui
• Test:

PIROGEN
– Sejumlah volume reagen LAL dan larutan uji (0,1 ml)
dicampurkan dalam tube uji)
– Inkubasi pada 37°C, 1 jam
– Balikkan tube dalam gerakan lambat, bacalah
hasilnya
PIROGEN
Metode LAL

• Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan

adanya endotoksin
• Metode kinetik turbidimetri: menggunakan kecepatan
pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin

PIROGEN
• Metode Kromogenik: menggunakan substrat kromogenik
sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi
endotoksin yang ada
Metode Kromogenik
• End-point test : berdasarkan
hubungan kuantitaif
antarakonsentrasi endotoksin dan
jumlah kromofor yang dilepaskan
pada akhir inkubasi
• kinetic test : metode untuk

PIROGEN
mengukurwaktu (onset) yang
diperlukan reaksi campuran untuk
mencapai absorbansi yang dapat
dideteksi, atau kecepatan
pembentukan warna
Metode Turbidimetri
• photometric test untuk mengukur
peningkatan kekeruhan

• end-point test : hubungan kuantitatif antara

konsentrasi endotoksin dengan kekeruhan
(Abs/ transmisi) dari reaksi setelah inkubasi

PIROGEN
• kinetic test : metode untuk mengukur waktu
(onset) yang diperlukan reaksi campuran
untuk mencapai absorbansi yang dapat
dideteksi, atau kecepatan pembentukan
kekeruhan
Kelebihan
• Murah, cepat dan akurat
• Dpat dilakukan pada laboratorium
• Spesifik untuk endotoxins gram-negative
• Dapat digunakan untuk:
– Radiopharmaceuticals dan cytotoxic agents

PIROGEN
– Produk dengan marked pharmacological or toxicological activity
pada kelinci (e.g. insulin)
– Produk darah yang seringkali memberikan hasil semu pada
percobaan dengan kelinci
– Water for injection dimana LAL test is potentially more stringent
siap pakai
TUGAS (1 kelompok 4 orang)
• Tuliskan langkah demi langkah untuk proses
pemeriksaan endotoksin dengan metode LAL
sesuai FI VI (pilih salah satu : turbidimetri atau
fotometri)
• Tuliskan cara pembacaan hasil sesuai metode
terpilih

PIROGEN