PIROGEN

DAN
UJI PIROGENITAS
Disusun Oleh :
BELVA LUTVIA
RESTU DUROTUN Y.
TUTI ALAWIAH
AMELIA
DARIS RUHWANDI
M. NOVAL

DEPARTEMEN FARMASI
UNIVERSITAS MATHLA’UL ANWAR
BANTEN
 PIROGEN • Pirogen merupakan
substansi yang mampu
• Berasal dari kata : menyebabkan demam
dan sering mencemari
• pyro yang artinya sediaan farmasi.
keadaan yang
berhubungan dengan • Penyebab utama :
panas. • substansi pirogenik yang
• dan kata gen yang diketahui paling aktif dan
artinya membentuk atau paling sering mencemari
menghasilkan. sediaan farmasi adalah
endoktoksin.
• Dan pirogenik lainnya
seperti bakteri, fungi ,
DNA–RNA virus dan
lain-lain (Suwandi,
1988).
 SEJARAH
• Pada tahun 1923 Seibert
membuktikan bahwa pirogen
adalah substansi yang tidak
tersaring, thermostabil, dan
non volatile.

Pada tahun 1937 Co Tui membuktikan

bahwa kontaminasi pirogen ini juga
terjadi pada alat-alat seperti wadah-
wadah untuk melarutkan obat suntik,
juga pada zat kimia yang digunakan
sebagai zat berkhasiat.
 ENDOTOKSIN

Endotoksin merupakan
suatu produk
mikroorganisme terutama
dari bakteri gram negatif

Endotoksin adalah suatu

molekul yang berasal dari
membran luar bakteri gram
negatif.
 PIROGEN
SUMBER PIROGEN
1. Air desilat yang telah
terkontaminasi oleh bakteri
yang tahan udara, yang
tumbuh dan menghasilkan
endotoksin.
2. Zat terlarut seperti NaCl dan
dekstrosa jga dapat
mengadung pirogen
3. Peralatan yang digunkan
sering menjadi media kultur
bakteri dengan kontaminasi
pirogenik.
4. Kontaminasi dapat berasal
daeri mikroorganisme di
udara atau dari debu.
SIFAT PIROGEN
• Thermostabil, sehingga
hanya dapat dihilangkan
dengan pemanasan pada
suhu 650ºC selama 1 menit,
250ºC selama 15 menit atau
180ºC selama 4 jam.
• Larut dalam air. Sehingga
tidak bisa memakai
penyaring bakteri.
• Tidak dipengaruhi oleh
bakterisida yang biasa.
• Tidak menguap, destilasi
biasa ada yang ikut
bersama percikan air.
• Berat molekul (BM) antara
15.000 – 4.000.000; dan
• Ukuran umumnya 1 – 50µm.
 GOLONGAN PIROGEN

Pirogen Endogen Pirogen Eksogen

• yaitu faktor eksternal tubuh

• yaitu faktor-faktor yang
berasal dari dalam tubuh
kita sendiri sebagai reaksi
kekebalan melawan
kuman penyakit yang
masuk ke tubuh.
• Jika suatu pirogen masuk ke
yang menyebabkan
gangguan pada fungsi tubuh
manusia. Misalnya bagian
dari sel bakteri dan virus.
Selain itu, bisa juga berupa
zat racun (toksin) yang
dihasilkan oleh bakteri atau
virus tertentu.
tubuh, maka pirogen
menjadi suatu benda asing
yang dapat menimbulkan
respon imun berupa
demam.
UJI PIROGENITAS
PENGERTIAN
• Uji pirogenitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui
apakan suatu sediaan uji bebas pirogen atau tidak,
dengan maksud untuk membatasi resiko reaksi demam
yang dapat diterima oleh pasien apabila diinjeksi dengan
suatu sediaan farmasi (Suwandi, 1988). .
Uji pirogenitas biasanya menggunakan
kelinci. Pengujian ini ditetapkan di USP
pertama kali pada tahun 1942 dan
merupakan pengujian resmi untuk
menentukan non-pirogenitas sediaan
farmasi. Pengujian meliputi pengukuran
kenaikan suhu kelinci setelah
penyuntikan larutan uji secara i.v (intra
vena)
 MACAM UJI PIROGENITAS
Rabbit Test
• Prinsip uji pirogenitas
menggunakan kelinci adalah
dengan injeksi intravena ke
tubuh kelinci di bawah
kondisi tertentu dan
selanjutnya dipantau dan
dicatat temperatur 3 kelinci
dalam jangka waktu
tertentu.
. LAL (Limulus amebocyte lysate)
• Prinsip uji LAL
menggunakan reagensia
yang dibuat dari sel darah
Limulus, ekstrak sel darah
ketam sepatu kuda (Limulus
polyphemus)
• LAL test didasarkan pada
observasi pembentukan gel
beku sewaktu endotoksin
bersentuhan dengan protein
pembeku dari amoebocytes
Limulus yang bersikulasi.
 Langkah pengujian Uji Pirogenitas Dengan Rabbit Test
1. Kalibrasi alat (termometer).
2. Pemilihan hewan uji (kelinci)
- kelinci dewasa yang sehat.
- adaptasikan kelinci pada suhu ruang selama 7 hari.
3. Puasakan kelinci selma waktu pengujian.
4. Catat suhu awal kelinci sebelum 30 menit waktu pengujian, dengan
mamasukan termometer pada anus kelinci.
5. Suntikan larutan uji secara intra vena (ditelinga) sesuai dosis.
6. Rekam suhu tubuh kelinci per 1 jam selama 3 jam.
Langkah pengujian Uji Pirogenitas
Dengan Rabbit Test
Penafsiran hasil
• Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun
menunjukkan kenaikan suhu 0,5oC atau lebih.
• Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu
0,5oC atau lebih. Lanjutkan pengujian dengan
menggunakan lima ekor kelinci. Jika tidak lebih dari tiga
ekor dari 8 ekor kelinci masing-masing menunjukkan
kenaikan suhu 0,5oC atau lebih dan jumlah kenaikan suhu
maksimal 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC sediaan
dinyatakan memenuhi syarat bebas pirogen.
 Langkah pengujian Uji Pirogenitas Dengan LAL
(Limulus amebocyte lysate).
• Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di mubasit limulus.
• sampel diambil 0,1 ml dan ditambahkan 0,1 ml LAL reagent, kemudian
diinkubasi pada suhu 37°C±1ºC selama 60±2 menit.
• Sampel dinyatakan positif mengandung endotoksin (> 0,25 EU/mL) bila
terbentuk gel dan sampel dinyatakan negatif endotoksin (< 0,25 EU/mL)
bila tidak terbentuk gel setelah tabung dibalik 180º secara perlahan.
• Tambahan test ini dapat digunakan dalam laboratorium farmaseutikal.
Test ini spesifik untuk endotoksin gram negatif, dimana test pirogen
kelinci sensitif untuk semua pirogen endotoksin dan sumber lain
disbanding gram negatif (Aulton, 1990).
APA ITU TAPAL KUDA?
Kelemahan Dan Kekurangan Tiap Metode
Meskipun demikian, pengujian pirogenitas menggunakan kelinci
masih menjadi pilihan utama karena:
• Metode ini telah lama dikenal dan digunakan untuk menguji
berbagai sediaan dan terbukti memberikan hasil memuaskan.
• Kelinci memiliki sensitivitas terhadap substansi pirogenik yang
mirip dengan manusia.
• Kenaikan suhu kelinci akibat substansi-pirogenik, sampai batas
tertentu masih dapat diterima oleh manusia, sehingga kenaikan
suhu kelinci tersebut dapat distandardisasi terhadap substansi
pirogenik yang dapat diterima manusia.
• Bangham menyebutkan, uji kelinci menggambarkan seluruh
respon farmakologis terhadap pirogen dan relevan dengan
respon pada manusia.
• Metode kelinci mampu mendeteksi semua pirogen termasuk
endoktoksin sedangkan LAL tidak.
Kelemahan Dan Kekurangan Tiap Metode
Sedangkan kelemahan metode uji pirogenitas menggunakan
kelinci dibandingkan dengan LAL Test antara lain:
• Memerlukan pemeliharaan dan perawatan hewan dan
laboratorium yang lebih intensif.
• Hewan harus dipelihara dalam ruangan dengan temperatur
tidak jauh berbeda dengan tempat percobaan.
• Pemeliharaan hewan harus dilakukan dengan sebaik mungkin
untuk menghindari infeksi penyakit yang dapat mengganggu
percobaan atau mengacaukan interpretasi hasil.
• Berat badan kelinci harus dijaga jangan sampai mengalami
penurunan yang berarti dalam 1 minggu menjelang digunakan.
• Sensitivitas dipengaruhi oleh musim, kegaduhan, kegelisahan,
makanan dan lain sebagainya. Kegelisahan akan dapat
menyebabkan kenaikan suhu relatip tinggi, sehingga
mengacaukan interpretasi hasil.
• Variabilitas biologis. Respon setiap kelinci terhadap substansi
yang sama belum tentu sama, sehingga terdapat variasi
kenaikan suhu pada tiap kelinci.
 Mekanisme pengaruh pirogen pada
timbulnya deman

sintesis Prostaglandin di Pusat

endotoksin Panas /
hipotalamus vosmotor deman

• Prostaglandin yang dihasilkan pirogen-pirogen itu kemudian

mensensitisasi reseptor dan diteruskan oleh resptor sampai
hypotalamus yang akan menyebabkan peningkatan derajat
standart panas hypotalamus (Hypotalamic Termostat).
Peningkatan derajat standart panas hypotalamus inilah yang
akan memicu sistem pengaturan suhu tubuh
(termoregulation) untuk meningkatkan suhu, maka terjadilah
demam.
• Pada saat kita demam, sebenarnya tubuh juga
mengeluarkan zat-zat tertentu untuk membantu
menurunkan demam. Misalnya arginine vasopressin
(AVP), melanocyte-stimulating hormone (MSH), dan
corticotropin-releasing factor. Efek anti demam ini yang
menyebabkan terjadinya fluktuasi suhu tubuh selama
kondisi demam. Untuk pengatasan demam, penggunaan
obat-obatan penurun panas harus dipertimbangkan
sebaik-baiknya.
• Prinsip kerja obat penurun panas umumnya yaitu dengan
menghambat biosintesis atau pembentukan
prostaglandin. Contoh obatnya adalah Parasetamol,
Aspirin, dll.
Metode Penghilanagan Pirogen
• Setiap sediaan steril yang akan
diinjeksikan ke dalam tubuh harus
lulus uji sterilitas dan uji
pirogenitas. Penghilangan pirogen
dengan beberapa metode, antara
lain:
1. Cara destilasi
2. Cara pemanasan
3. Cara penyerapan
4. Cara depyrogenasi
5. Dengan penukar ion
6. Dengan gamma radiasi
7. Getaran ultrasonik.
Cara menghilangkan pirogen
- Inaktifasi endotoksin
a. Hidrolisis asam basa
b. Oksidasi
c. Alkilasi
d. Pemanasan kering pada suhu
tinggi (250 selama 30-45 menit
atau 170-180oC, selama 3-4 jam)
e. Pemanasan basah
f. Radiasi ionisasi
g. Polymixin B dan limulus
amebasit lysat
- Penghilangan endotoksin
a. Membilas dengan API steril
b. Destilasi
c. Ultrafiltrasi
d. Osmosa balik
e. Karbon aktif
f. Daya tarik elektrostatik
g. Daya tarik hidrofobik
Substansi dan preparat yang harus bebas
pirogen, antara lain:
• Air untuk injeksi.
• Larutan infus.
• Antibiotika.
• Garam asam organik (misalnya:
Calcium glukonas).
• Obat tetes dan substansi lain, yang
diberikan intravena sebagai
diagnostic. Misalnya: Inulin -
Indigocarmin - Conggored , dsb.
• Produk-produk darah. Misalnya :
albumin.
• Produk-produk hewani. Misalnya:
heparin, gelatin (sebagai penganti
plasma), chorionic gonadotropin.
KESIMPULAN
• Pirogen merupakan substansi yang mampu
menyebabkan demam dan sering mencemari sediaan
farmasi.
• Penyebab utama endotoksin, Dan pirogenik lainnya
seperti bakteri, fungi , DNA–RNA virus dan lain-lain.
• Pirogen dapat bersumber dari: pelarut, zat aktif,
peralatan, timbul pada proses penyimpanan.
• Pirogen terbagi ke dalam 2 golongan yaitu pirogen
endogen dan pirogen eksogen.
• Untuk menguji sediaan farmasi mengandung pirogen
perlu dilakukan Uji Pirogenitas.
• Uji pirogenitas dibagi menjadi 2 yaitu dengan Rabbit Test
dan LAL (Limulus amebocyte lysate).
TERIMA KASIH