Penentuan Potensi Antibiotik

Dr. Herman Suryadi, M.Si (Kalab)

Prof. Dr. Amarila Malik, MSi
Prof. Dr. Maksum Radji, Mbiomed
Dr. Ratika R, M.Si
Marina Ika, M.Si., Apt
 <131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
 Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi sesuai
dengan efek daya hambatnya terhadap mikroba uji
 Perbedaan kadar dan potensi
 Dua metode umum : cara lempeng dan cara tabung
 Cara lempeng : menggunakan kertas cakram atau selinder baja, efek difusi
antibiotik pada medium agar.
 Cara tabung : turbidimetri, efek larutan antibiotik terhadap turbiditas
mikroba

2
Pada metode lempeng, antibiotic uji/ standar akan berdifusi dari cakram kertas
atau sumur pada permukaan agar yang mengandung sejumlah tertentu bakteri.
Pada metode ini yang akan diukur adalah diameter area jernih.
 
Sedangkan metode turbidimetri biasa digunakan untuk antibiotik sukar larut air
misalnya gramisidin. Pada metode ini yang akan diukur adalah kekeruhan dari
larutan dengan menggunakan Spektrofotometer pada Panjang gelombang 530
nm.
A. Penetapan Potensi Antibiotik Menurut
Farmakope Indonesia III
Bahan
1. Antibiotik uji (kapsul amoksisilin trihidrat)
2. Antibiotik standar
3. Bakteri standar (Staphylococcus aureus ATCC 25953)
4. Medium cair
 Kaldu tioglikolat
5. Medium padat
 Base layer (lapisan dasar) = medium 2
 Seed layer (lapisan perbenihan) = medium 11
 Agar miring
6. Bahan pembantu
 Dapar fosfat pH 8 ± 0,1
 Larutan NaCl fisiologis
A. Penetapan Potensi Antibiotik Menurut
Farmakope Indonesia III
Alat
1. Cawan petri
2. Ose
3. Penyaring bakteri
4. Silinder stainless steel (besi tahan karat) atau cakram
kertas
5. Pipet mikro
6. Pinset ujung runcing
7. Jangka sorong
8. Inkubator
Prosedur kerja
A. Pembuatan inokulum
B. Pembuatan lapisan dasar (base layer)
C. Pembuatan lapisan pembenihan (seed layer)
D. Pembuatan stok antibiotik standar dan uji
E. Pengenceran larutan stok amoksisilin
A. Pembuatan Inokulum
1. Tanam bakteri standar pada agar miring, eramkan 18-24
jam pada temperatur 37oC.
2. Siapkan 4 tabung steril. Tabung pertama diisi 2 ml NaCl
fisiologis steril dan 3 tabung selanjutnya diisi 9 ml.
3. Suspensi bakteri diencerkan dengan cara:
 Ambil bakteri dari agar miring dengan ose dan masukkan ke
tabung 1, vortex. Setarakan kekeruhan dengan Mc Farland III
(109 bakteri/ml).
 Ambil 1 ml dari tabung I dan masukkan ke tabung II. Vortex.
 Ambil 1 ml dari tabung II dan masukkan ke tabung III. Vortex.
 Ambil 1 ml dari tabung III dan masukkan ke tabung IV. Vortex.
4. Gunakan pengenceran pada tabung IV sebagai inokulum
yang setara dengan 106 bakteri/ml.
Skema Pembuatan Inokulum
1 ml 1 ml 1 ml

109 bakteri/ml 108 107 106

2 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl
fisiologis fisiologis fisiologis fisiologis

Setarakan kekeruhan
dengan Mc Farland III Inokulum
B. Pembuatan Lapisan Dasar (Base
Layer)
 Siapkan 6 cawan petri steril.
 Tiap cawan petri diisi 10 ml lapisan dasar.
 Ratakan sampai menutupi seluruh permukaan alas
cawan petri
 Biarkan membeku
Skema Penyiapan Base Layer

Medium

10 ml 10 ml 10 ml
C. Pembuatan Lapisan Pembenihan (Seed
Layer)
 Siapkan 6 tabung reaksi steril.
 Isi tabung dengan 4 ml lapisan perbenihan yang telah
dicairkan.
 Setelah suhu mencapai 54-60oC masukkan1 ml
suspensi bakteri yang setara dengan 106 bakteri/ml.
Homogenkan.
 Tuangkan seluruhnya pada setiap cawan petri yang
sudah berisi base layer.
 Ratakan pada permukaan base layer dan diamkan
hingga membeku.
 Skema Pembuatan Seed Layer

1 ml Lakukan pada keenam cawan petri yang telah

diiisi base layer

Seed layer
Seed layer 50o-60oC
Tuang ke seluruh permukaan
base layer
Base layer
Inokulum 4 ml medium seed
106 bakteri/ml layer
↓
Vortex
D. Pembuatan Larutan Stok Amoksisilin
Trihidrat / Obat yang Diuji Potensinya
 Timbang seksama sampel 57,4 mg amoksisilin
trihidrat atau setara dengan 50 mg amoksisilin
anhidrat.
 Larutkan dengan air suling secukupnya dan encerkan
dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 ± 0,1 hingga 50,0
ml sehingga diperoleh stok 1000 μg/ml
 Ambil 2,5 ml larutan tersebut lalu encerkan dengan
larutan dapar fosfat pH 8,0 ± 0,1 hingga 25,0 ml.
 Maka diperoleh larutan stok dengan kadar 100 μg/ml.
 Saring larutan stok 100 μg/ml dengan filter bakteri.
E. Pengenceran Larutan Stok
Amoksisilin
 Pipet 4,5 ml larutan stok (100 μg/ml), cukupkan volume hingga
50 ml sehingga diperoleh larutan konsentrasi 9 μg/ml  UI
 Pipet 3 ml larutan stok (100 μg/ml), cukupkan volume hingga 25
ml sehingga diperoleh larutan konsentrasi 12 μg/ml  U2
 Pipet 4 ml larutan stok (100 μg/ml), cukupkan volume hingga 25
ml sehingga diperoleh larutan konsentrasi 16 μg/ml  U3
 U1 : U2 = 3 : 4
U2 : U3 = 3 : 4

Prosedur pembuatan larutan standar amoksisilin (S) sama dengan

prosedur pembuatan larutan uji
S1 : S2 = 3 : 4
S2 : S3 = 3 : 4
 Skema Pembuatan Stok Antibiotik

Pipet 2,5 ml ad 25 ml
buffer fosfat pH 8
1000 100 μg/ml
μg/ml Filter

Timbang:
-57,4 Amoksisilin trihidrat
(setara dengan 50 mg Amoksisilin baku) 4,5 ml 3 ml 4 ml
Ad 50 ml buffer fosfat pH 8

50 ml 25 ml 25 ml

U1 = S1 U2 = S2 U3 = S3
9 μg/ml 12 μg/ml 16 μg/ml
 Cara Meneteskan Larutan Uji (U) dan
Larutan Standar (S)
 Letakkan 6 cakram kertas (Φ 6 mm) steril pada cawan petri steril
 Teteskan larutan uji (U1) 20 μl pada cakram kertas
 Pindahkan dengan pinset pada keenam cawan petri yang telah berisi
base layer dan seed layer
 Ulangi untuk larutan U2, U3, S1, S2 dan S3.

20 μl

U1 = S1 U2 = S2 U3 = S3
9 μg/ml 12 μg/ml 16 μg/ml
Pemasangan Silinder / Cakram Kertas
pada Lapisan Agar dalam Cawan Petri
 Letakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertas dengan jarak
satu sama lain ± 20-35 mm seperti gambar di bawah ini:

S1 S1 S1

S3 U2 S3 U2 S3 U2

S2 U3 S2 U3 S2 U3

U1 U1 U1

S1 S1 S1

S3 U2 S3 U2 S3 U2

S2 U3 S2 U3 S2 U3

U1 U1 U1
 Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37oC
 Hasil: Dihitung sesuai rumus

Standar (S) Uji (U)

Jumlah zona kadar Σ S1 Σ U1
rendah
Jumlah zona kadar Σ S2 Σ U2
tengah
Jumlah zona kadar tinggi Σ S3 Σ U3
Jumlah sediaan Σ (S1 + S2 + S3) = S Σ (U1 + U2 + U3) = U
Kontras linier S3 – S1 = Ls U3 – U1 = Lu
Perhitungan
 Keterangan:
 b = slope regresi zona log
konsentrasi semua sediaan
 d = banyaknya ragam
konsentrasi setiap sediaan = 3
 h = Banyakya sediaan
termasuk standar = 2
 n = banyaknya penggandaan
tiap perlakuan = 6
 I = interval log konsentrasi
berdampingan
(log S1 – log S2 = log S2 – log S3)
 Rasio potensi Ru = antilog Mu
 Potensi = Ru x 100%