Uji Batas Mikroba

Dr. Herman Suryadi, M.Si (Kalab)

Prof. Dr. Amarila Malik, MSi
Prof. Dr. Maksum Radji, Mbiomed
Dr. Ratika R, M.Si
Marina Ika, M.Si., Apt
Uji Batas Mikroba
 Tujuan
 Untuk memperkirakan jumlah bakteri aerob yang terdapat di
dalam semua jenis perbekalan farmasi

 Prinsip
 Sediaan yang telah dihomogenkan dan diencerkan dengan
pengenceran yang sesuai ditanam pada media agar
 Diinkubasi pada 37oC selama 24-48 jam
 Dihitung koloni yang tumbuh
 STANDAR MIKROBIOLOGI & PENGUJIAN
MIKROBIOLOGI UNTUK PRODUK FARMASI
 Sediaan farmasi adalah obat, bahan obat, obat
tradisional,
dan kosmetika. (UU No. 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan)
Bahan Sediaan
Baku Air Murni Farmasi
• Zat Aktif
(Purified •
Non-steril
• Eksipien Water) • Steril
BAHAN BAKU FARMASI
 Bahan baku untuk produk farmasi dapat berupa bahan
kimia atau bahan yang berasal dari alam
 Bahan yang berasal dari alam lebih cenderung
terkontaminasi mikroorganisme lebih berat dibandingkan
bahan sintetik kimia

6
 Kategori Bahan Baku Alam (Grigo, 1976)

1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak bahan alam

yang sudah dimurnikan (rata-rata 10 cfu/g atau
mL)
2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan alam
(rata-rata 102 cfu/g atau mL)
3. Ekstrak tanaman (rata-rata 103 cfu/g atau mL)
4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit
mengalami proses (rata-rata 104 cfu/g atau mL)
5. Produk hewan atau tanaman yang tidak
mengalami proses (rata-rata 105 cfu/g atau mL)

7
Mikroorganisme kontaminan yang sering
dijumpai dalam bahan baku alam
 Bacillus
 Enterobacteriaceae
 Staphylococcus
E.coli
 Aspergillus
 Penicillium
 Mucor
 Rhizopus
Salmonella

8
Jenis air yang digunakan untuk Proses
Farmasi
 Air murni (purified water)
 Air dengan tingkat pemurnian yang tinggi (highly purified
water)
 Air untuk injeksi (Water for Injerction)

DI USP ditambah lagi dengan :

 Air lunak (softened water)
 Air untuk pembilasan terakhir (water for final rinse)
 Uap air bertekanan murni atau bersih (Pure or Clean
steam)
Air Murni

 Diperoleh dari pasokan air yang memenuhi

syarat Air Minum atau setara dengan air
minum (tap water) yang mutunya diatur
secara internal
 Air pasokan secara umum diolah dengan
proses penukaran ion,ultrafiltrasi dan/atau
proses osmosis terbalik (Reverse Osmosis)
Air Murni
 Tidak mengandung bahan kimia yang ditambahkan
 Diperoleh dengan menggunakan proses yang memadai
 Memenuhi syarat konduktivita air
 Memenuhi syarat TOC (Total Organic Carbon)
Air untuk Injeksi
 Memenuhi persyaratan air murni
 Diperoleh dengan menggunakan proses yang memadai dan dimurnikan dengan
penyulingan (distilasi)
 Memenuhi persyaratan uji endotoksin bakteria : tidak lebih dari 0,25 EU/mL
 Disediakan dengan cara yang memadai untuk meminimalkan pertumbuhan
mikroorganisme
Spesifikasi Air Murni dan WFI (USP)
PW (Purified WFI (Water for
Water) Injection)
Water conductivity < 1,3 μS/cm at < 1,3 μS/cm at 25°C*
and pH 25°C* pH 5-7 pH 5-7
Total Organic < 0.5 ppm < 0.5 ppm
Carbon (TOC)
Aerobic Microbial < 100 CFU/ mL < 10 CFU/100 mL
Contamination (<0.1 CFU/mL)
Endotoxin content Not Specified < 0.25 EU/mL
Production Obtained by Obtained by suitable
Methods suitable process process and purified
by distillation.
*In-line measurement, from equivalent values from USP table
CFU=Colony Forming Units
All Pharmaceutical water must also meet the EPA standard for microbiological quality of
potable water
Mencegah Cemaran Mikroorganisme
 Dari Rancang bangun ( misalnya mencegah deadlegs)
 Aliran air : turbulen
 Suhu
 Perawatan yang baik (misalnya mencegah kebocoran)
 Sanitasi : bahan Kimia, pemanasan
 Produk Farmasi Steril
 Untuk produk parenteral, sediaan obat mata, termasuk larutan lensa kontak ,
dan produk-produk yang diberikan pada luka terbuka atau untuk proses
irigasi rongga tubuh.
 Uji sterilitas perlu dilakukan
 Syarat Steril : Sterility Assurance Level dengan probabilitas sama atau lebih
baik dari 10 -6, artinya dalam satu juta sediaan steril hanya boleh maksimum
1 yang tidak steril.
 Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya pertumbuhan mikroba
pada media Fluid Thioglycollate (FTM) dan Soyabean Casein Digest
(SCD)pada 30-35°C (bakteri) dan 20-25°C (fungi) selama 7 dan 14 hari.

16
Produk Farmasi Non-Steril
 Tidak ada aturan tunggal yang mengatur, tergantung pada farmakope negara
masing-masing
 Tidak mengandung mikroba yang dapat menyebabkan infeksi akibat penggunaan
obat tersebut (medication-borne infection)
 TVC (Total Viable Count) dalam jumlah tertentu dan tidak adanya patogen enterik
dalam bahan baku nya.

17
 Persyaratan Kualitas Mikrobiologi Sediaan
Farmasi versi FIP (1976)
Gol. Jenis Sediaan Persyaratan
1a Injeksi Steril – Farmakope
1b Obat mata, sediaan untuk Bebas mikroba yang mempunyaidaya hidup/g
bagian tubuh yg bebas atau mL
mikroba, sediaan untuk luka
bakar, tukak berat
2 Sediaan topikal pada lesi kulit, Mikroba yg mempunyai daya hidup maks 102 /g
hidung, tenggorokan (resiko atau mL, dan tidak mengandung
tinggi) Enterobacteriaceae, P.aeruginosa, S.aureus

3 Sediaan lain Mikroba yg mempunyai daya hidup maks 103 –

104 bakteri anaerob, 102 ragi dan kapang /g atau
mL,
Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak
mengandung Salmonella, P.aeruginosa,
S.aureus,
Enterobacteriaceae lain maks. 102 /g atau mL

18
Batas kontaminan mikroba pada bahan dan
sediaan obat asal tanaman (versi UNIDO,1990)
Bahan/ Bakteri Ragi dan Baketri Salmonella Staphylococcu
Sediaan kapang coliform s

Sediaan < 104 /g < 102 /g - - -

obat asal
tanaman

Bahan < 107 /g < 104 /g - - -

obat asal
tanaman

Ket.: (-) tidak boleh ada

UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)

19
Uji Batas Mikroba- ALT
 Metode sebar

inkubasi

1 ml sampel dipipetkan Sampel disebarkan

Koloni permukaan
ke media padat

Metode tuang Koloni di dalam Koloni

medium permukaan

inkubasi

1 ml sampel dipipetkan Ditambahkan media

Amati dan hitung
ke cawan petri steril agar yang dicairkan
jumlah koloni yang
tumbuh
Bahan dan Media
 Media agar (Nutrient Agar, Plate Count Agar/PCA)
 Media agar selektif (Potato Dextrose Agar, Mannitol Salt
Agar, EMB Agar, Sabouraud Dextrose Agar)
 Larutan NaCl fisiologis
 Buffer fosfat pH 6-8
 Pepton Dilution Fluid (PDF)
 Angka Lempeng Total

Angka Lempeng Total

Cara kerja: Metode Tuang (Pour Plate)
 Penyiapan sampel:

1. Penanganan wadah dan kemasan

 Wadah kertas dan plastik
Pada bagian yang akan dibuka dibersihkan dengan alkohol 70%
lalu dipanaskan dengan api dan dibuka kemasannya secara aseptis
 Wadah botol
Tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70% lalu dipanaskan di
atas api sebentar dan tutupnya dibuka secara aseptis
 Wadah kaleng
Permukaan kaleng dicuci bersih, dibersihkan dengan alkohol
70%. Bagian yang akan dibuka dilewatkan di atas api kemudian
dibuka secara aseptis
 Angka Lempeng Total

Cara kerja,,,cont’d
2. Homogenisasi dan pengenceran sampel
a. Untuk bahan padat
 Timbang 1 gram bahan, larutkan dalam larutan buffer fosfat pH
6-8 atau Pepton Dilution Fluidi (PDF) sampai 10 ml
 Siapkan 3 tabung reaksi yang diisi dengan 9 ml NaCl fisiologis
 Pipet 1 ml bahan yang telah dihomogenkan ke dalam tabung 1
 Pipet 1 ml bahan dari tabung 1 ke tabung II, homogenkan
 Pipet 1 ml bahan dari tabung 1I ke tabung III, homogenkan.
(pengenceran yang diperoleh 1:100; 1:1000; 1:10.000
 Dari masing-masing pengenceran diambil 1 ml, masukkan ke
cawan petri
 Angka Lempeng Total

Cara kerja,,,cont’d
 Tuangkan Nutrien Agar cair (suhu 45-55oC) sebanyak 15-20
ml. Goyangkan sampai rata dan biarkan membeku.
 Eramkan dalam inkubator temperatur 37oC selama 18-24 jam.
 Hitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh.

b. Untuk bahan cair

 Pipet 1 ml bahan ke dalam tabung reaksi yang telah diisi 9 ml
buffer fosfat pH 7,2. Homogenkan (pengenceran :10).
 Lakukan seri pengenceran dengan larutan NaCl fisiologis
seperti pada cara bahan pada sehingga diperoleh pengencera
1:100; 1:1000; 1:10.000
 Angka Lempeng Total

Cara kerja,,,cont’d
 Dari masing-masing hasil pengenceran tersebut dipipet 1 ml
dan dimasukkan ke dalam cawan peti
 Tuangkan ke dalam masing-masing cawan petri 15-20 ml
Nutrient Agar/Plate Count Agar yang telah dicairkan (suhu
45-50oC). Goyangkan hingga merata
 Biarkan membeku dan eramkan pada suhu 37 oC selama 18-24
jam
 Amati hasilnya dan hitung jumlah koloni yang tumbuh
 Skema
1 ml 1 ml

Timbang Larutkan dg
1 gram saos 10 ml dapar 10-1 10-2 10-3
9 ml dapar 9 ml dapar 9 ml dapar
fosfat pH 7,2
fosfat fosfat fosfat

1 ml 1 ml 1 ml

10-1 10-2 10-3

NA 60oC Tuang
15 ml NA

10-1 10-2 10-3

 Jumlah bakteri total = jumlah rata-rata koloni x kebalikan
angka pengenceran

 Contoh perhitungan:
Pengenceran Jumlah koloni bakteri
Petri 1 Petri II Petri III
10-1 50 45 55
10-2 17 19 18

 Angka kuman = 50 x 10 = 500 koloni (menggunakan aturan

jumlah koloni 30 – 300)
 C. Jamu Timbang Larutkan dg 50 ml Diamkan 5
5 gram jamu 50 ml dapar menit agar
fosfat pH 7,2 mengendap
1:10

0,5 ml 0,5 ml

1:10

1 2 3 4 5 6 7 8

A B C 9 10 11
Blangko