BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental secara in vitro dengan

rancangan acak lengkap postest only control group design. Kelompok uji dan
kelompok kontrol di nilai pasca intervensi. Rangkaian penelitian ini dimulai dari
pembuatan ekstrak biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.) kemudian
dilanjutkan dengan skrining fitokimia dan uji aktivitas antibakteri terhadap
Pseudomonas aeruginosa.
Uji aktivitas bakteri ini menggunakan metode dilusi tabung untuk menentukan
konsentrasi hambat minimum (KHM) ekstrak biji buah langsat (Lansium
domesticum Cor.) terhadap Pseudomonas aeruginosa dan dilanjutkan dengan
penentuan konsentrasi bunuh minimum (KBM) pada media agar Mueller Hinton.

B. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu : Desember 2014 sampai dengan Mei 2015

Tempat : Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran dan Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Tanjungpura Pontianak.

C. Alat dan Bahan Penelitian

Penelitian ini menggunakan sampel biji buah langsat (Lansium domesticum

Cor.) yang diperoleh dari perkebunan di Desa Punggur Kecamatan Sei Kakap
Kabupaten Kubu Raya, Kalimantan Barat yang telah dideterminasi di
Laboratorium Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Tanjungpura Pontianak.
Ekstraksi. Bahan yang digunakan adalah pelarut etanol 96%, kertas saring dan
kertas alumunium foil. Alat yang digunakan adalah oven, penampan, wadah

29
 30

maserasi, penggiling, blender, pisau, neraca analitik, labu ukur, corong pisah, labu
bulat, rotary evaporator, erlenmeyer, autoklaf, dan eksikator.
Analisis fitokimia. Bahan yang digunakan adalah, pereaksi Mayers, FeCl3
1%, FeCl3 5%, HCl pekat, HCl 2N, serbuk magnesium, CH3COOH glasial,
larutan H2SO4 pekat. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi,
gelas ukur, erlenmeyer, batang pengaduk, penangas (hot plate) neraca analitik,
mikropipet, pipet tetes, masker, sarung tangan, autoklaf, laminar air flow.
Kultur bakteri. Bahan yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas
aeruginosa, agar nutrien miring, medium cair Mueller Hinton, larutan NaCl 0,9%,
suspensi McFarland 0,5. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung
reaksi, inkubator, jarum ose, autoklaf, masker dan sarung tangan.
Uji antibakteri. Bahan yang digunakan adalah Ekstrak biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.), suspensi bakteri, akuades, dimethyl sulfoxide (DMSO
10%), larutan NaCl 0,9%, medium cair Mueller Hinton, agar Mueller Hinton,
kapas steril. Alat yang digunakan adalah inkubator, autoklaf, jarum ose, tabung
reaksi, rak tabung reaksi, mikropipet, cawan petri, masker dan sarung tangan.

D. Populasi dan Sampel Penelitian

D.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah biji buah langsat (Lansium domesticum
Cor.)
D.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah biji buah langsat (Lansium domesticum
Cor.) yang diperoleh dari kebun langsat di Desa Punggur Kecamatan Sei Kakap.

E. Variabel dan Definisi Operasional

E.1. Variabel

Variabel dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.), Pertumbuhan bakteri uji, suhu, waktu inkubasi,
sterilitas, dan media. Konsentrasi ekstrak biji buah langsat merupakan intervensi
yang akan diberikan untuk dinilai efeknya dalam penelitian ini. Pertumbuhan
 31

bakteri uji ini merupakan efek yang akan dinilai akibat intervensi yang telah
diberikan. Pertumbuhan bakteri uji akan dipengaruhi oleh suhu, waktu inkubasi,
sterilitas, dan media sehingga harus dipertahankan dalam kondisi optimum.
.
E.2. Definisi Operasional

E.2.1. Konsentrasi Ekstrak Biji Buah Langsat

Variasi konsentrasi yang diberikan didapat langsung dari pengenceran yang

berlaku pada metode dilusi tabung, yaitu 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%,
3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, dan 0,19%. Konsentrasi ekstrak berupa skala
ordinal.

E.2.2. Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan bakteri dinyatakan dengan tumbuh dan tidak tumbuh pada setiap
konsentrasi ekstrak biji langsat setelah disubkultur pada medium tumbuh. Data
yang dihasilkan berskala nominal.

E.2.3. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Konsentrasi hambat minimum (KHM) merupakan konsentrasi terendah yang

dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang dinilai dengan melihat kekeruhan
pada tabung secara kasat mata, dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
Hasil pengukuran dikategorikan menjadi jernih dan keruh. Data yang dihasilkan
berskala nominal.

E.2.4. Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)

Konsentrasi bunuh minimum (KBM) merupakan konsentrasi terendah dimana

pertumbuhan bakteri kurang dari 0,01%. KBM dinilai dengan melihat
pertumbuhan bakteri yang disubkultur pada medium tumbuh.
 32

E.2.5. Kontrol Positif

Kontrol positif pertumbuhan bakteri merupakan 1 ml suspensi bakteri pada 1

ml medium cair Mueller Hinton yang akan menampakan kekeruhan. Suspensi ini
juga distreaking pada agar Mueller Hinton untuk mendapatkan kontrol positif
pertumbuhan koloni.

E.2.6. Kontrol Negatif

Kontrol negatif pertumbuhan bakteri merupakan 1 ml ekstrak biji buah langsat

murni sisa hasil pengenceran pada 2 ml medium cair Mueller Hinton yang akan
menampakkan kejernihan. Larutan ini juga distreaking pada agar Mueller Hinton
untuk mendapatkan kontrol negatif pertumbuhan koloni. Kontrol negatif ini
digunakan pula untuk memastikan sterilitas ekstrak.

E.2.7. Kontrol Pelarut

Kontrol pelarut pertumbuhan bakteri merupakan 1 ml suspensi bakteri yang

ditambah 1 ml DMSO 10% dan 1 ml medium cair Mueller Hinton yang
memberikan penampakan keruh. Suspensi ini juga distreaking pada agar Mueller
Hinton untuk menyingkirkan kemungkinan adanya aktivitas antibakteri dari
pelarut DMSO 10% yang digunakan.

F. Prosedur Penelitian

F.1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Tanjungpura Pontianak. Determinasi ini
untuk memastikan bahwa sampel yang diambil dari kebun langsat di Desa
Punggur Kecamatan Sei Kakap merupakan tanaman langsat (Lansium domesticum
Cor.).
 33

F.2. Pemanenan

Pemanenan dilakukan pada waktu pagi hari saat buah telah matang yang
dinilai dari perubahan warna dan bentuk buah (Gunawan, 2004). Buah langsat
(Lansium domesticum Cor.) diambil dari kebun langsat yang terdapat di Desa
Punggur Kecamatan Sei Kakap, Kubu Raya.

F.3. Pembuatan Simplisia

Langkah-langkah pembuatan simplisia biji buah langsat adalah sebagai
berikut:
1. Pengumpulan bahan baku, dilakukan pemanenan buah langsat yang telah
matang dengan cara melihat perubahan warna dan bentuk buah (Gunawan,
2004).
2. Sortasi basah, dilakukan pemilahan hasil panen buah langsat yang masih
segar terhadap bagian tanaman lainnya yang tidak digunakan, buah yang
rusak, dan benda asing lainnya (Gunawan, 2004).
3. Pengelupasan kulit dan daging buah dilakukan sebelum pencucian
(Gunawan, 2004).
4. Pencucian, dilakukan pembersihan buah langsat dari kotoran yang melekat
menggunakan air PAM yang mengalir (Gunawan, 2004).
5. Pengubahan bentuk, dilakukan lakukan menggunakan pisau atau mesin
perajang khusus sehingga diperoleh irisan tipis sehingga memperluas
permukaan bahan baku dan bahan baku semakin cepat kering (Agoes,
2009 dan Gunawan, 2004).
6. Pengeringan, dilakukan dengan teknik penjemuran di bawah sinar
matahari langsung dengan suhu berkisar 35C - 40C yang dilakukan
selama tiga hari pada pukul 10.00 sampai 15.00 WIB (Mamun et al.,
2006).
7. Sortasi kering, dilakukan pemilahan bahan setelah proses pengeringan
memisahkan dengan bahan yang rusak dan gosong akibat proses
pengeringan (Gunawan, 2004).
 34

8. Penggilingan, dilakukan menggunakan blender untuk memperluas

permukaan bahan dengan ukuran simplisia yang lebih kecil, namun tidak
menjadi serbuk (Agoes, 2009).
9. Pengepakan bahan simplisia menggunakan plastik dan disimpan pada
ruangan dengan suhu kamar 15C - 30C (Gunawan, 2004).

F.4. Sterilisasi alat dan bahan

Alat dan bahan, kecuali ekstrak biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.),
disterilisasi didalam autoklaf selama 20 menit dengan mengatur tekanan sebesar
15 dyne/cm3 (1 atm) dan suhu sebesar 121oC setelah dicuci bersih, dikeringkan
dan dibungkus dengan kertas terlebih dahulu (Kusuma, 2012).

F.5. Pembuatan ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan menggunakan metode maserasi. Maserasi

merupakan proses penyarian sederhana dengan cara merendam serbuk simplisia
dalam cairan penyari (Depkes RI, 1986). Serbuk simplisia yang halus membantu
proses maserasi dapat berlangsung dengan baik. Pembuatan ekstrak dilakukan
dengan langkah sebagai berikut:
1. Serbuk simplisia disiapkan masing-masing sebanyak 500 gram direndam
dalam 2000 ml larutan etanol 96%.
2. Rendaman simplisia didiamkan selama 24 jam dengan diaduk beberapa
kali menggunakan batang pengaduk (Ditjen POM Depkes RI. 2000).
3. Rendaman simplisia disaring dengan menggunakan penyaring kasar
hingga diperoleh filtrat I dan debris I (Korompis et al, 2010).
4. Debris I dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama pada langkah ke-1,
masing-masing sebanyak 1000 ml selama 24 jam dengan beberapa diaduk
(Korompis et al, 2010).
5. Masing-masing rendaman simplisia ke-2 disaring lagi untuk mendapatkan
filtrat II dan debris II (Korompis et al, 2010).
 35

6. Debris II kembali dimaserasi menggunakan pelarut yang sama pada

langkah ke-1 dan ke-4 sebanyak 1000 ml selama 24 jam dengan beberapa
kali diaduk (Korompis et al, 2010).
7. Masing-masing rendaman simplisia ke-3 disaring lagi dan diperoleh filtrat
III dan debris III (Korompis et al, 2010).
8. Filtrat I, II, dan III dari masing-masing pelarut selanjutnya digabungkan
dan dihomogenkan kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator
pada suhu 50C hingga diperoleh ekstrak kasar. (Korompis et al, 2010 dan
Atmoko dan Maruf, 2009).
9. Masing-masing ekstrak kasar yang diperoleh ditimbang.
10. Ekstrak kasar yang telah diperoleh disimpan dalam eksikator (Effendy
Laydiana, 2013).

F.6. Penetapan susut kering

Ekstrak etanol 96% biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.) yang didapat
diperiksa susut pengeringannya untuk menentukan ekstrak yang tersebut termasuk
dalam ekstrak cair, kental atau ekstrak kering. Jika persentase susut pengeringan
berada dalam kisaran 0-5% berarti ekstrak tersebut termasuk ekstrak kering, jika
dalam kisaran 5-30% termasuk dalam ekstrak kental dan apabila berada dalam
kisaran >30% termasuk dalam ekstrak cair (Depkes RI, 1979).
Susut pengeringan adalah pengurangan berat bahan setelah dikeringkan
dengan cara yang telah ditetapkan. Suhu penetapan adalah 105oC. Penetapan susut
pengeringan dilakukan dengan cara menimbang 1 g zat dalam bobot timbang
(krusibel porselen) dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu
penetapan selama 30 menit dan telah ditara. Ratakan zat dalam botol timbang
(krusibel porselen) dengan menggoyangkan botol, hingga menyerupai lapisan
setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm, masukkan dalam ruang pengering
(oven), buka tutupnya, keringkan pada suhu penetapan hingga bobot tetap.
Sebelum setiap pengeringan dibiarkan botol (krusibel) dalam keadaan tertutup
mendingin di dalam desikator hingga suhu kamar. Setelah itu dihitung persentase
susut pengeringannya (Depkes RI, 1995a; Menkes RI, 2009).
 36

%susut pengeringan=
x 100%

F.7. Skrining Fitokimia

F.7.1. Pemeriksaan Alkaloid

Ekstrak sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu

ditambahkan 5 tetes kloroform dan beberapa tetes pereaksi Meyer. Jika terbentuk
endapan putih mengindikasikan adanya kandungan alkaloid dalam sampel uji
(Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan alkaloid dilakukan triplo.

F.7.2. Pemeriksaan Fenol

Ekstrak sampel sebanyak empat gram ditambahkan beberapa tetes air

panas, kemudian ditambahkan beberapa tetes pereaksi FeCl3 1%. Jika terbentuk
perubahan warna merah, hijau atau ungu menunjukan adanya kandungan fenol
dalam sampel uji (Atmoko dan Maruf, 2009). Pemeriksaan fenol dilakukan
triplo.

F.7.3. Pemeriksaan Flavonoid

Ekstrak sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu

ditambahkan dengan serbuk magnesium sebanyak satu gram dan larutan HCl
pekat. Perubahan warna larutan menjadi warna kuning menandakan adanya
kandungan sampel uji (Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan flavonoid dilakukan
triplo.

F.7.4. Pemeriksaan Saponin

Ekstrak sampel sebanyak 2 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu

ditambahkan dengan air dan dikocok dengan kuat selama 10 menit. Jika terdapat
buih yang menetap menunjukan adanya kandungan saponin dalam sampel uji
(Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan saponin dilakukan triplo.
 37

F.7.5. Pemeriksaan Tanin

Ekstrak sampel sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung reaksi, kemudian

ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl3 5%. Jika terjadi perubahan warna

menjadi biru tua menunjukan adanya kandungan tanin dalam sampel uji (Lailatul

et al., 2010). Pemeriksaan tanin dilakukan triplo.

F.7.6. Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid

Ekstrak sampel sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 1 ml CH3COOH glasial
dan 1 ml larutan H2SO4 pekat. Jika warna berubah menjadi biru atau ungu,
menunjukan adanya kandungan kelompok senyawa steroid. Jika terjadi perubahan
warna menjadi merah, menunjukan adanya kandungan kelompok senyawa
terpenoid (Lailatul et al., 2010). Pemeriksaan terpenoid dan steroid dilakukan
triplo.

F.8. Pembuatan Agar Mueller Hinton

Agar Mueller Hinton adalah media tumbuh standar untuk pengujian antibiotik
(Cavalieri et al., 2005). Satu liter agar Mueller Hinton dibuat dengan cara
mencampurkan 38 gram serbuk agar Mueller Hinton dengan 1 liter akuades.
Campuran tersebut dihomogenkan kemudian disterilkan menggunakan autoklaf
dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.

F.9. Identifikasi Bakteri Uji

F.9.1. Karakterisasi Jenis Gram dengan Pewarnaan Gram

Kaca objek dibersihkan dengan alcohol sehingga terbebas dari lemak, difiksasi
diatas Bunsen sampai kering, diteteskan NaCl fisologis. Bakteri dari media NA
diambil dengan jarum ose, diletakkan pada tetesan NaCl fisiologis. Biarkan
mongering diudara dan fiksasi diatas api. Kemudian diteteskan karnol gentian
violet selama 60 detik. Setelah itu dicuci dengan akuades. Diteteskan larutan
lugols selama 60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan akuades. Buang warna
dengan meneteskan alkohol 96% sampai tidak ada warna violet lagi. Setelah itu
 38

cuci dengan akuades sampai bersih. Tetesi dengan safranin dan dibiarkan selama
45 detik. Setelah itu preparat dicuci kembali dengan akuades, dikeringkan dan
diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri gram positif akan menunjukkan warna
ungu sedangkan bakteri gram negatif akan menunjukkan warna merah
(Gandasoebrata, 2007).

F.9.2 Karakterisasi pada Media Selektif

Bakteri Pseudomonas aeruginosa dari media NA digoreskan di atas

permukaan media Cetrimide agar. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37C selama
18-24 jam. Hasil positif apabila terbentuk koloni berwarna hijau biru.

F.9.3 Karakterisasi Uji Biokimia

F.9.3.1 Uji sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon. Uji sitrat dilakukan dengan cara
menginokulasikan bakteri kedalam media Simmons Citrate Agar, inkubasi pada
suhu 37C selama 24 jam, warna biru menunjukkan reaksi positif, warna hijau
menunjukkan reaksi negatif (Waluyo, 2008).

F.9.3.2 Uji Motil

Uji motilitas dilakukan dengan menginokulasikan bakteri dengan cara
menusukkan bakteri menggunakan ose ke dalam tabung reaksi yang berisi media
MIO (Motility-Indole-Ornithine) hingga ke dasar media. Selanjutnya media
diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Bakteri yang bersifat motil ditandai
dengan koloni yang menyebar, sedangkan jika pertumbuhan bakteri tidak
menyebar atau hanya tumbuh pada bekas tusukan saja maka bakteri tersebut
bersifat non motil (Waluyo, 2008)

F.9.3.3 Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

TSIA adalah media yang kaya nutrisi yang dirancang untuk membedakan
bakteri berdasarkan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan gas H2S. Bakteri uji
dari media peremajaan diambil menggunakan jarum ose kemudian diinokulasikan
 39

pada media Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Pada dasar medium (butt)
diinokulasikan dengan cara menusuk, dan pada bagian miring (slant) ditanam
secara zig-zag pada permukaannya. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC
selama 24 jam. (Irianto, 2006; Pronadisa, 2011).

F.10. Pembuatan stok kultur dan inokulum bakteri

Sebanyak satu ose dari biakan murni bakteri Pseudomonas aeruginosa

digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan Nutrien agar miring,
ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasi selama 18-24 jam pada
suhu 37C.
Bakteri hasil inkubasi dengan menggunakan jarum ose steril lalu
disuspensikan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9% steril,
kemudian dihomogenkan dengan vortex hingga diperoleh kekeruhan suspensi
yang sama dengan kekeruhan standar Mc. Farland, ini berarti konsentrasi suspensi
bakteri adalah 108 CFU/ml. setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet
0,1ml biakan bakteri (108 CFU/ml), dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi
larutan NaCl 0,9% sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen, maka diperoleh
suspensi bakteri dengan konsentrasi 106 CFU/ml.

F.11. Uji Aktivitas Antibakteri

Dalam penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan

menggunakan tiga kelompok ekstrak biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.)
yang disari dengan pelarut etanol 96%. kelompok ekstrak terdiri dari 10
subkelompok perlakuan dengan konsentrasi dosis ekstrak biji buah langsat
(Lansium domesticum Cor.) yang berbeda yaitu konsentrasi 100%, 50%, 25%,
12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,19% dan 3 subkelompok kontrol
yaitu kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol pelarut.
 40

F.11.1. Penghitungan Jumlah Replikasi

Penelitian ini menggunakan 13 subkelompok yang terdiri dari 10

subkelompok perlakuan dan 3 subkelompok kontrol. Dalam menentukan jumlah
replikasi untuk setiap perlakuan dapat menggunakan rumus Federer (Supranto,
2000):
(t - 1) (r - 1) 15
(13-1) (r 1) 15
(12) (r 1) 15
12r -12 15
12r 15+12
12r 27
r 27:12
r 2,25 (pembulatan r 3)
Maka jumlah replikasi dalam setiap subkelompok perlakuan adalah sebanyak
3 kali.

F.11.2. Penyiapan Larutan Stok

Penyiapan larutan stok dilakukan dengan melarutkan 6 gram ekstrak biji buah
langsat (Lansium domesticum Cor.) dalam DMSO 10% yang ditambahkan hingga
6 ml. Penyiapan larutan stok ini dilakukan ekstrak etanol 96% yang digunakan
untuk tiga kali replikasi. Larutan stok ini kemudian dianggap konsentrasi uji
100%.
F.11.3. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

1. Disiapkan tabung reaksi sebanyak 39 tabung untuk tiga replikasi uji yang
sama untuk masing-masing seri membutuhkan 13 tabung.
2. Disusun tabung seperti gambar di bawah ini kemudian diberikan kode
nomor.
 41

Gambar 3.1 Susunan tabung pada metode dilusi tabung

3. DMSO 10% sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung ke-2 sampai
tabung ke-10. (Saputra, 2012)
4. Larutan stok yang telah jadi dimasukan ke dalam tabung ke-1 sebanyak 1
ml dan dianggap sebagai konsentrasi 100% dalam pengujian ini.
5. Larutan stok sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung ke-2 yang telah
berisi DMSO 10% kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex,
sehingga konsentrasinya menjadi 50% larutan dalam tabung ke-2.
6. Pengenceran secara seri dilakukan dari tabung ke-2 sampai tabung ke-10
dengan memindahkan 1 ml larutan dari tabung ke-2 ke dalam tabung ke-3.
Kemudian tabung ke-3 dihomogenkan dan diambil 1 ml larutannya untuk
dipindahkan ke dalam tabung ke-4. Demikian seterusnya sampai tabung
ke-10. Larutan dalam tabung ke-10 sebanyak 1 ml diambil dan
dipindahkan ke dalam tabung ke-12.
7. Larutan medium cair Mueller Hinton sebanyak 2 ml ditambahkan ke
dalam tabung ke-12, kemudian dihomogenkan. Larutan dalam tabung ke-
12 ini berperan sebagai kontrol negatif.
 42

8. Larutan medium cair Mueller Hinton sebanyak 2 ml dimasukan ke dalam

tabung ke-11 dan DMSO 10% sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung
ke-13.
9. Suspensi bakteri sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam tabung ke-1 sampai
tabung ke-11 serta tabung ke-13, selanjutnya tabung ke-11 berperan
sebagai kontrol positif dan tabung ke-13 sebagai kontrol pelarut.
10. Tabung reaksi ditutup dengan menggunakan kapas steril atau penutup
tabung untuk menghindari kontaminasi (Saputra, 2012).
11. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam (Saputra,
2012).
12. Setiap tabung diamati dan dibandingkan dengan kontrol positif dan kontrol
negatif ada tidaknya pertumbuhan bakteri berdasarkan tingkat kekeruhan
setiap tabung.
13. Langkah 2 sampai 12 dilakukan 3 kali replikasi.

F.11.4. Penentuan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)

1. Tabung-tabung yang telah dilakukan pungujian Konsentrasi Hambat

Minimum (KHM) disubkultur pada agar Mueller Hinton dengan cara
streaking (Khunaifi, 2010 dan Saputra, 2012).
2. Biakan yang distreaking pada agar Mueller Hinton diinkubasi pada suhu
37 C selama 18-24 jam (Saputra, 2012).
3. Langkah 1 dan 2 dilakukan untuk setiap konsentrasi pada ketiga kelompok
ekstrak.
4. Koloni hasil inkubasi dinyatakan dengan tumbuh atau tidak tumbuh.
Koloni yang tidak tumbuh pada konsentrasi terendah merupakan
Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dalam penelitian ini.
 43

Gambar 3.2 Cara Melakukan streaking pada Agar Mueller Hinton

G. Analisa Hasil Penelitian

Data yang diperoleh dari hasil penelitian terdiri dari data konsentrasi ekstrak
biji buah langsat (Lansium domesticum Cor.) yang merupakan data berskala
ordinal dan pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa yang merupakan data
berskala nominal. Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel dan grafik
serta gambar. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif setelah dilakukan 3
kali pengulangan untuk menilai kemampuan aktivitas antibakteri ekstrak biji buah
langsat dalam menghambat dan membunuh bakteri Pseudomonas aeruginosa
berdasarkan konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi bunuh
minimum (KBM).
 44

H. Alur penelitian

Determinasi tanaman

Persiapan alat dan bahan

Pemanenan dan pembuatan simplisia

Sterilisasi alat dan bahan

Skrining
fitokimia Pembuatan ekstrak

Ekstrak Etanol 96%

Ekstrak Etanol 96 %Biji Subkelompok kontrol

Buah Langsat 100%, Kontrol positif
50%, 25%, 12,5%, 6,25%, Kontrol negatif
3,125%, 1,56%, 0,78%, Kontrol pelarut
0,39%, 0,19%

Penyiapan bakteri Pseudomonas aeruginosa

Penentuan Inkubasi 24 jam

KHM Pengujian antibakteri
(metode dilusi)

Penanaman di agar
Mueller Hinton
Penentuan (inkubasi 24 jam)
KBM

Analisa Hasil

Gambar 3.3 Alur Penelitian