LAPORAN PRAKTIKUM IV

D. pertanyaan-pertanyaan diskusi dan tugas

1. interpretasikan hasil percobaan yang telah anda lakukan dan simpilkan apakah sampel
obat yang telah anda analisis mengandung jumlah mikroba melebihi batas yang ditetapkan
atau tidak ! jaleskan (berdasarkan general chapter USP no.41 tahun 2017)

Jawaban : Semua hasil total koloninnya melebihi 300 koleni. Hal ini terjadi karena proses
enumerasi dilakukan diruangan lab biasa bukan di dalam laminar air flow , jadi ada indikasi
terkontaminasi bakteri penyebar.

2. Apa fungsi dari uji control positif dan negative ? apakah wajib dik=lakukan uji control
ini pada uji enumerasi.

Jawaban : Uji control negative dan positif wajib dilakukan untuk mengetahui adak/tidaknya
pertumbuhan koloni dalam agar. Pada uji control positif jika larutan buffer berubah menjadi
keruh maka ditentukan adanya pertumbuhan koloni yang baik pada agar . untuk control
negative , jika larutan buffer tetap jernih maka tidak adanya pertumbuhan koloni pada media
agar tersebut.

3. Bagaimana cara perhitungan koloni untuk mendapatkan nilai ALT dan AKK ?

Jawaban : - Nilai ALT : Setelah inkubasi di pilih cawan petri dari satu pengenceran yang
menunjukan jumlah koloni anatara 30-300 koloni. Jumlah rata rata koloni dihitung lalu dikalikan
dengan factor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap gram .

- Nilai AKK : setelah inkubasi pilih cawan petri daro satu pengenceran dengan jumlah
koloni 10-150 koloni jumlah koloni di rata rata lalu dikalikan dengan factor
pengencerannya.
-
1. Uji lempeng total
A.alat dan bahan
1. cawan petri 5
2. tabung reaksi 5
3. mikropipet 1ml
4. blutipe
5.erlenmeyer
6.mortir dan stamper
7. media TSA
8. larutan pengenceran (deper phospat)
9. Tablet Vitamin
10. Kapas dan kassa
11.Alumunium foil
12.timbangan analitik
13.kertas perkamen
14. gelas ukur 10ML
15. Inkubator
16.bunsen
17.aquadest

B. Prosedur kerja
1. siapkan alat dan bahan yang sudah disterilkan
2. membuat plung 5 buah , untuk tutup tabung reaksi
3. siapkan 5 tabung reaksi , masukan masing –masing larutan dapar phosta sebanyak
9ml . kemudian beri tanda 10-1 sampai 10-5. Tutup menggunakan plung.
4. Grus tablet vitamin dalam mortar, kemudian timbang sebnayak 1 gram dan larutkan
dengan aquadest 10ml di dalam Erlenmeyer add homogen
5. nyalakan Bunsen , untuk fiksasi . siapkan mikropipet 1ml dan bluetape pasangkan
6. ambil 1 ml larutan vitamin . masukakn kedalam tabung reaksi 10-1 add homogeny
7. ambil 1ml larutan vitamin masukkan kedalam tabung reaksi 10-2 add homogen.
8. ambil 1ml dari tabung reaksi 10-3 add homogen. Begitu juga seterusnya sampai tabung
10-5.
9. ambil 5ml cawan petri beri tanda 10-1sampai 10-5.
 10. masukkan 1ml dari setiap tabung reaksi kedalam cawan sesuai dengan tandanya.
11. kemudian tanbahkan 20ml meida TSA, Goyangkan perlahan membentuk angka 8
tunggu sampai memadat.
12. setelah memadat , inkubasi pada suhu 30-35 celsius dengan posisi cawan terbalik.
13. amati pertumbuhannya
14. jangan lupa setiap membuka mulut tabung reaksi dan Erlenmeyer dipanaskan (fiksasi)
dulu, dan sebelum ditutup kembali juga di fiksasi.

2. Angka kapang kemih

A. Alat dan bahan

1. Cawan petri 5
2. Tabung rekasi 5
3. Mikropipet 1ml
4. Bluetape
5. Erlenmeyer
6. Kapas dan kassa
7. Timbangan analitik
8. Kertas perkamen
9. Gelas ukur 10ml
10. Spatula
B. Prosedur kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang sudah disterilkan.
2. Membuat plung 5 buah untuk tutup tabung reaksi
3. Siapkan 5tabung reaksi , masukkan masing masing larutan dapat phospat
sebanyak 9ml. tutup dengan plung. Beri tanda 10-1 sd 10-5.
4. Tmbang 1gram . extraksasi dan sawo, larukan dengan aquabest 10ml add
homogen.
5. Nyalakan Bunsen untuk fiksasi tabung reaksi
6. Ambil 1ml larutan Extrak daun sawo ke dalam tabung reaksi 10-1 ad homogen,
fiksasi tutup.
 7. Ambil lagi 1ml dari tabung 10-1 masukkan kedalam tabung 10-2 ad homogeny
fiksasi tutup.
8. Ambil kembali 1ml dari tabung 10-2 masukkan kedalam tabung 10-3 ad homogen
fiksasi tutup.
9. Ambil 5 cawan petri, beri tanda 10- sd 10-5
10. Ambil 1ml masing masing dari tiap tabung 10-1 sd10-5 kedalam cawan petri
sesuai dengan tandanya.
11. Tambahkan media SOA 20ml , goyakan seara perlahan memebentuk angka 8
tunggu sampai memdadat
12. Inkubasi pada suhu 20-25 celcius selama 3-5 hari dengan posisi cawan terbalik.
13. Amati pertumbuhan koloninya.
14. Jangan lupa untuk memanaskan mulut tabung reaksi dan mulut Erlenmeyer setiap
kali membuka dan menutupnya.

PEMBAHASAN

Dalam pratikum ini , pratikum melalukan pengujian sediaan farmasi . pengujian ini
dilakukan untuk menentukan suatu bahan atau sediaan obat memenuhi spesifikasi mutu secara
mikrobiologi yang telah ditetapkan, termasuk jumlah sampel yang akan digunakan dan
interprerasi hasil uji. Metode ini tidak dapat diaplikasikan untuk produk yang mengandung
mikroba variable sebagai bahan aktif seperti vaksin.

Teknik enumerasi yang dipratikan adalah teknik enumerasi mikroba secara tidak langsung yaitu
dengan metode angka lempeng total (ALT) dan angka kapang kamir (AKK) . dimana prinisipnya
itu hanya menghitung jumlah bakteri atau kapang / kamir yang hidup. Yaitu yang dapat
membelah dan memperoleh keturunan, teknik ini tidak dapat menghitung setiap sel tunggal
mikroba per 1ml sampai dapat diperoleh dengan menghasilkan jumlah CFU(Colony forming
unit) yang terhitung dengan volume sampel yang dihasilkan kemudian dibagi pengenceran yang
digunakan.

Pada metode angka lempeng total sampel yang diuji adalah tablet vitamin 1gram yang
dilarutkan dengan aquadest 10ml. kemudian dilakukan pengenceran dengan larutan dapar
phospat sebanyak 10-1 sd 10-5 pada tabung reaksi. Kemudian dari masing masing tabung,
diambil 1ml untuk dituangkan kedalam cawan petri yang sudah diberikan tanda 10-1 sd 10-5 .
metode yang dipakai adalah metode tuang dengan media agar TSA . masing masing cawan petri
dituangkan 20 ml media TSA, Kemudian digoyangkan perlahan membentuk angka 8, setelah
memadat di inkubasi pada suhu 30-35 celsius selama 1-2 hari , diperoleh total colony (CFU)
sebanyak 337 koloni. Pada sampel yang di uji.

Pada metode angka kapang kamir, caranya sama dengan angka lempeng total, yang beda sampel
dan medianya saja, untuk AKK sampel yang digunakan adalah ekstrak daun sawo dan medianya
media SDA , hasil pengamatanya diperoleh koloni sebanyak 324 koloni pada sampel yang di uji.

KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. Metode enumerasi merupakan pengujian untuk memperkirakan jumlah mikroba yang

terdapat dalam sediaan farmasi.
2. Pengujian dilakukan untuk menetukan suatu bahan atau sediaan obat memenuhi
spesifikasi mutu secara mikrobiologi yang telah ditetapkan.
3. Enumerasi secara tidak langsung menggunakan AKK untuk pengujian bahan ekstrak
daun sawo dengan media SDA, tumbuh koloni kapang/ kamir setelah diinfubasi sebanyak
342 koloni pada sampel yang diuji.
4. Enumerasi secara tidak langsung menggunakan ALT untuk pengujian tablet vitamin
dengan media TSA, Tumbuh koloni bakteri setelah di inkubasi sebanyak 337 koloni pada
sampel yang di uji.
5. Saat melakukan metode ini. Sampel harus diencerkan terlebih dulu, agar koloni mikroba
lebih mudah dihtung.

Saran : Praktikum harap berhati – hati saat melakukan percobaan dan menggunakan alat – alat
laboratorium terutama bahan gelas.
 LAPORAN PRAKTIKUM V

D. pertanyaan-pertanyaan diskusi dan tugas

1. Mengapa untuk identifikasi bakteri pengecatan gram perlu dilakukan

Jawaban : Karena untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjalskan

ukuran bakteri , melihat stukur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuda,
menghasilkan sifat sifat fisik dan kimia yang khas dari bakteri dengan zat dengan sekitarnya.

2 . Kenapa gram positif berwarna ungu dan gram negative berwarna merah :

Jawaban : Karena bakteri gram negative dan positive merupakan bakteri yang memiliki lapisan
peptidolsilkan tebel dan ding ding selnya mampu menyerap warna violet contoh :
Stephylococcus.

Sedangkan bakteri gram negative memiliki lapisan peptidogika tipis dan dinding selnya mampu
menyerap warna merah.

1. Pewarna Gram
A. Alat dan bahan
1. Objek glass
2. Cover glass
3. Spatula
4. Mikrobiologi
5. Beaker glass
6. Pipet glass
7. Jarum ose
8. Bunsen
9. Gentian violet
 10. Llugol
11. Eosin
12. Alcohol 96%
13. Minyak imersi
14. Alcohol 70%
15. Spedil
16. Kultur murni bakteri staphylococcus auraus media agar miring.
B. Prosedur kerja
1. Siapkan alat dana bahan
2. Sterilkan tangan menggunakan alcohol 70%
3. Sterilkan objek glass dan cover glass menggunakan alcohol 70%.
4. Buat lingkaran pada objek glass
5. Balik objek glass , sehingga bagian yang digunakan bukan bagian yang ada
lingkarannya.
6. Tetsi objek glass dengan aquadest 1 tetes diatas gambar lingkaran tadi, ratakan.
7. Nyalakan Bunsen , buka tutup media agar miring panaskan mulut tabung,
kemudian ambil 1 ose biarkan di tetesi aquadest tadi kemudian fiksasi objek glass
diatas Bunsen (jarum ose dalam keadaan sudah dipijarkan atau steril).
8. Pijarkan lagi jarum osen, dan mulut tabung kemudian tutup kembali.
9. Setelah fiksasi sampai kering kemudian tetesi gentian violet 1tetes tunggu selama
1menit , ratakan untuk tetap berada dilingkaran kemudian bilas dengan aquadest
dan keringkan.
10. Kemudian tetesi lugol 1tetes , tunggu 1menit bilas dengan aquadest dan
keringkan.
11. Kemudian celupkan objek glass tadi ke dalam alcohol 69% selama 20 detik ,
keringkan.
12. Kemudian tetesi eosin 1tetes tunggu 1menit bilas dengan aquadest.
13. Kemudian tetesi 1tetes minyak imersi , kemudian langsung tutup menggunakan
cover glass yang sudah di sterilkan.
14. Kemudian amati dalam mikroskop
C. Hasil pengamtan

Diperoleh hasil pengamatan , bakteri stapilococcus aureus mengikat warna Kristal

violet (ungu) dan bentuknya bulat bulat seperti buah anggur , bakteri pada objek glass
terlihat menumpuk , karena proses prepares kurang maksimal (apusan bakteri kurang
maksimal.

PEMBAHASAN
Pewarnaaan garam merupakan teknik yang digunakan untuk mengelompokan
bakteri gram negative dan gram positif. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan
bersifat asam dan basa, bagian basa mempunyai muatan positif dan asam berperan
memberikan warna yang mampunyai muatan positif dan asam berperan memberikan
warna yang mempunyai mutan negative.
Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri gram positif dan gram negative
dapat diamati dengan jelas, bakteri gram positif mengikat warna pertama dengan kuat
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh warna
penutup. Hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoflasmanya yang
mempunyai afinitas kuat terhadap komplek crystal violet dan iodin. Bakteri gram
negative tidak mengikat zat warna pertma secara kuat , sehingga dapat di lunturkan
oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna penutup (zat warna kedia)>
Pada pratikum ini digunakan bakteri staphylococcus aureus , dimulai dari pembuatan
preparat afusen bakteri sampai fusan siap di amati di mikroskop.
Pada pengamatan di mikroroskop tampakn bakteri stapylococus aureus mengikat
warna violet , bentuk dari bakteri bulat bulat seoerti buah anggur namun bakteri tidak
menyebar, tapi tampak menumpuk hal ini di karnakan pada pembuatan preparat
bakteri tidak menyebar sehingga bentuk dari penerannya numpuk, suspensinya terlalu
padat, jadi terlalu tebal harusnya afusan yang baik itu adalah tampak selput tipis.
 KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil pratikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan :

1. Pewarnaan gram dapat digunakan untuk pengklasifikasi bakteri gram positif dan
gram negative.
2. Bakteri gram positif dkan mengikat kuat pewarnaan pertama yaitu cristal violet ,
sedangkan bakteri gram negative tidak mengikat pewarnaan pertama violet
sehingga dapat dilunturkan dan dapat diwarnain oleh zat pewarna penutup ( eosin)
merah.
3. Pembuatan afusan bakteri pembuatan afusan pada hasil jumlah bakteri yang
terdapat pada afusan harus cukup sehingga dapat dilihat bentuk dan panataanya.
4. Bakteri staphylococcus aurus merupakan bakteri gram positif karane ia mengikat
warna violet.

Saran :

1. Praktikum harap berhati hati saat melukukan bakteri percobaan dan menggunakan alat
alat laboratorium terutama bahan gelas.
2. Pratikum harap memperhatikan langkah langkah percobaan agar hasil yang didapat
maksimal.