BAB III

METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan
melakukan serangkaian penelitian untuk mengetahui efektivitas ekstrak etanol
daun kemangi terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli penyebab diare
dengan konsentrasi tertentu.
B. Waktu dan Tempat
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan . 2014, di Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Farmasi Politeknik Kesehatan Kementerian Kesehatan
RI Makassar.
C. Prosedur kerja
1. Penyiapan Sampel Uji
a. Pengambilan Sampel
Bahan yang digunakan adalah daun kemangi yang diperoleh dari
Pasar Pabaeng-baeng Kota Makassar.
b. Pembuatan Simplisia
Daun kemangi yang telah diperoleh, dibersihkan dengan air.
Kemudian, diseleksi lalu di potong kecil-kecil dan di keringkan
dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang dan terhindar dari
sinar matahari langsung. Setelah kering, daun kemangi di pisahkan
dari zat asing yang masih tertinggal. Simplisia daun kemangi yang
telah bersih di simpan pada tempat yang aman dan terhindar dari
matahari langsung,untuk menghindari kerusakan simplisia.
2. Ekstraksi
Daun kemangi yang telah dipotong kecil-kecil, di timbang
sebanyak 100 gr. Kemudian, dimasukkan ke dalam bejana
maserasi. Ditambahkan pelarut etanol hingga di atas bahan baku setinggi
2-3 cm, ditutup dan di biarkan selama 5 hari di tempat yang terlindung
dari cahaya sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari, ekstrak disaring ke
dalam wadah dan ampasnya di ekstraksi kembali dengan pelarut
etanol. Ekstrak etanol yang di peroleh kemudian dikumpulkan dan
dipekatkan dengan Rotavapor pada suhu 60
o
C hingga diperoleh ekstrak
kental. Kemudian, ekstrak Kental diuapkan kembali di atas waterbath,
sampai larutan etanol menguap dan yang tersisa sari daun kemangi.
Kemudian dibuat ekstrak etanol dengan beberapa konsentrasi.
3. Sterilisasi Alat
a. Sterilisasi dengan udara panas dan kering
Cara ini terutama dipakai untuk sterilisasi alat-alat gelas seperti
erlenmeyer, beker gelas, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur,
batang pengaduk. Sterilisasi ini dilakukan dengan oven. Tapi sebelum
alat-alat gelas tersebut dimasukkan dalam oven, semua alat-alat gelas
dicuci sampai bersih.Keringkan, dan disumbat/dibungkus,kemudian
siap untuk di sterilkan dengan oven pada suhu 160
o
-180
o
C selama 2
jam. Setelah temperatur waktu tercapai,alat dimatikan agar suhu
temperatur turun.
4. Pembuatan media
Media yang digunakan adalah media padat Nutrient Agar dan media cair
Peptone Water.
a. Media padat Nutrient Agar
Media agar padat dibuat dengan cara 1 gr Nutrient Agar (NA)
dilarutkan dalam 50 ml aquadest,kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer
dan ditutup dengan kapas. Selanjutnya,dipanaskan sampai mendidih dan
dimasukkan dalam 5 tabung reaksi(masing-masing tabung reaksi
sebanyak 7 ml untuk media peremajaan biakan murni antibakteri) dan
ditutup dengan menggunakan kapas. Selanjutnya, media disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan tekanan 2 atm.
Kemudian, media untuk peremajaan diletakkan dalam keadaan miring
pada suhu kamar sampai media memadat.
b. Media cair Peptone Water.
Media cair dibuat dengan cara di timbang sebanyak 2 gr Pepton
Water. Kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquadest. Di aduk hingga
homogen. Kemudian di tambahkan metilen blue sebanyak 1 pipet aduk sampai
homogen dan dimasukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan kapas.
Selanjutnya, dipanaskan sampai mendidih, kemudian didinginkan dalam
suhu ruang. Selanjutnya, media cair dimasukkan ke dalam 10 tabung
reaksi masing-masing 9 ml. Disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit
pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan tekanan 2 atm.
5. Peremajaan Bakteri
Biakan murni Escherichia coli diambil dari stok laboratorium
sebanyak 1 ose, kemudian dibiakkan di Media PW selama 1 x 24 jam.
Apabila media PW terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning
berarti pembiakan bakteri berhasil. Kemudian, diambil 1 ose biakan
bakteri dari media PW dan digoreskan ke media miring NA tabung
ditutup dengan kapas dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 x 24 jam.
Dari media NA diambil lagi 1 ose biakan bakteri untuk dibuat suspensi
bakteri,dimana biakan tersebut di masukkan dalam tabung reaksi yang
berisi aquadest.dan di homogenkan. Biakan pun siap di gunakan untuk
pengujian.
6. Pengujian Antibakteri
10 Tabung reaksi yang berisi media PW sebanyak 9 ml
ditambahkan masing-masing 1 ml ekstrak daun kemangi dengan
konsentrasi yang berbeda yaitu, 6%, 7%, 8% , 9%, 10%. 11%, 12%, 13%,
14% dan sebagai kontrol 0% . Setelah itu, dimasukkan suspensi bakteri
sebanyak 1 ose dengan cara terlebih dahulu ose harus dipijarkan. Lalu,
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi biakan bakteri secara
aseptis. Ose tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi
media cair PW dan sampel daun kemangi dengan kosentrasi 6 % secara
aseptis pula. Homogenkan. Pijarkan ose kembali setelah digunakan. Hal
ini dilakukan sampai konsentrasi akhir. Diinkubasi pada suhu 37
o
C
selama 1 x 24 jam,dan apabila terjadi perubahan warna dan kekeruhan
sehingga dapat ditentukan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dari
sampel ekstrak etanol daun kemangi terhadap bakteri Escherichia coli .
Kemudian diinkubasi kembali selama 1 x 24 jam untuk menentukan MBC
(Minimum Bacteridial Concentration) dari ekstrak etanol daun kemangi
terhadap bakteri Escherichia coli.
7. Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif yaitu melihat
perubahan warna dan kekeruhan sehingga dapat ditentukan MIC
(Minimum Inhibitory Concentration) dari sampel ekstrak etanol daun
kemangi terhadap bakteri Escherichia coli setelah inkubasi selama 1 x 24
jam. Kemudian diinkubasi kembali selama 1 x 24 jam untuk menentukan
MBC (Minimum Bacteridial Concentration) dari ekstrak etanol daun
kemangi terhadap bakteri Escherichia coli.
8. Kesimpulan
Kesimpulan dibuat berdasarkan hasil penentuan MIC (Minimum
Inhibitory Concentration) dan MBC (Minimum Bacteridial
Concentration).