[TYPE THE COMPANY NAME]

Protokol Pengujian
Antimikroba (Bakteri
dan fungi)
Metode Broth Mikrodilusi (Microdlution Broth)

2019

[TYPE THE COMPANY ADDRESS]

 Protokol Antimikroba
Broth Microdilution
1. Penimbangan Sampel
Cara menimbang:
- Siapkan Tabung Eppenddorf bersih dan KOSONG.
- Siapkan botol via bersih dan kosong.
- Micropipet 300 μL single chanell dan tip-nya
- Sendok isolat
- Untuk menimbang sampel serbuk dan minyak berbeda. caranya,

Serbuk :
- Masukan botol vial kedalam timbangan analitiik, kemudian di TERA
- Labeli tutup tabung eppendorf sesuai dengan nama zat yang mau ditimbang, contoh :
Isolat RR1.
- Kemudian letakan epenndorf diatas botol vial tadi, kemudian TERA kembali.
- Masukan sedikit-sedikit isolat serbuk kedalam eppendorf hingga mencapai 1 mg,
atau lebih sedikit tapi tidak boleh lebih dari 1,3 mg.

Minyak :
- Masukan botol vial kedalam timbangan analitiik, kemudian di TERA
- Labeli tutup tabung eppendorf sesuai dengan nama zat yang mau ditimbang, contoh :
Isolat RR1
- Timbang berat kosong tabung eppendorf lalu catat di buku.
- Larutkan isolat minyak dengan pelarut yang sesuai (yang bisa melarutkannya, seperti
untuk senyawa fraksi nonpolar bisa larut di pelarut n-heksan)
- Jangan terlalu banyak melarutkan agar pelarut mudah untuk menguap.
- Ambil sekitar 130 μL dengan pipet mikro masukan kedalam tabung eppenndorf.
- Keringkan dan jangan tutup tabung eppendorf agar pelarut cepat menguap (bisa
gunakan lemari asam untuk menguapkan)
- ketika sudah kering, timbang kembali tabung eppendorf berisi senyawa /sampel uji
- Berat eppendorf dan sampel uji dikurangi dengan berat kosong ependorf.
- Catat berat sampel uji (biasanya kalau ambil 130 μL beratnya sekiitar 2,3 mg)

2. Sterilisasi
Sterilisasi alat menggunakan Autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121°C. (kalau
menggunakan autoklaf di kedokteran tinggal nyalakan kemudian tekan tombol ON
berwarna hitam bulat , alat akan otomatis mati sendiri). Sterilisasi dilakukan Pagi Hari
supaya bisa kerja seharian.
Alat – alat yang akan disterilisasi :
 Labu erlenmeyer 250/500 mL (3-5 buah) sudah Berisi media (langkah-langkah buat
media lihat pembuatan media)
 Tabung Reaksi (5-8 buah)
 Cawan Petri (6-8 buah)

2
  Pipet tetes
Semua alat dibungkus dengan kertas, selanjutnya sterilisasi. Untuk alat yang tidak bisa
disterilisasi menggunakan autoclave dapat menggunakan oven atau di dalam LAF.

3. Pembuatan Media
Media-media yang digunakan Yaitu MHA,MHB, PDA, sama RPMI .
Keterangan :
 MHA (Mueller Hinton Agar) : Dipakai untuk peremajaan /kultur bakteri.
 MHB (Mueller Hinton Broth) : Dipakai untuk pengujian bakteri, digunakan
didalam 96-well plate , karena berbentuk cair dan tidak memadat.
 PDA (Potato Dextrose Agar) : Dipakai untuk Peremajaan / kultur Fungi
 RPMI (Rosswel Park Memorian Institute) : Diapakai untuk pengujian
fungi/jamur, digunakan dalam 96-well plate, karena berbentuk cair dan tidak
memadat.

Langkah- Langkah pembuatan :

a. MHA
MHA akan memadat setelah didinginkan, sehingga Caranya :
 Timbang 8,5 gram (timbang bersamaan dengan labu erlenmeyer, labu erlenmeyer
bersih letakan di atas timbangan kemudian tera timbangannya, lalu masukan
serbuk medianya) Catatan : Kenapa beratnya 8,5g? karena saran pembuatan yang
ada dibotol itu 34 g/1 Liter aquadest. Karena mau dibuat dalam 250 mL (1/4 dari
1000 mL) jadi 34g/4 = 8,5 g. Tapi ingat setiap media beda-beda saran
pembuatannya, jadi dibaca dikemasan botolnya.
 Larutkan dengan Aquadest 250 mL (Tidak harus aquades, bisa dengan aqua atau
air mineral lainnya)
 Panaskan dengan Hot-plate ,suhunya (85-90 °C)
 Aduk dengan magnetik stirer
 Sementara dipanaskan buat tutup labu erlenmeyer (dibuat dari kapas dengan kain
kassa serapat mungkin), serta labeli nanti erlenmyer (Tulis Nama media, pemilik,
tanggal pembuatan, contoh : MHA, Rizal, 4 Oktober 2019).
 Kalau media sudah bening, tandanya sudah media sudah jadi.
 Tutup mulut erlenmeyer menggunakan tutup yang sudah dibuat sebelumnya,
kemudan di sterilisasi.
 Setelah dilakukan sterilisasi media dituang kedalam cawan petri steril.

b. PDA
Cara pembuatan PDA sama dengan MHA, namun jumlahnya berbeda yaitu
9,75g dilarutkan dengan 250 mL aquadest. Pembuatan media sesuaikan dengan
saran takaran pembuatan dari botol media. Kenapa 9,75g karena untuk PDA saran
pembuatannya 39g/1000 mL.

3
 c. MHB
Cara pembuatan MHB sama dengan MHA, namun berat jumlah serbuk media yang
ditimbang berbeda (nanti lihat dibotolnya berapa). Media untuk pengujian dibuat
sebanyak mungkin, bila nanti nanti dalam proses pengerjaan peneliti punya stock
yang cukup. Total volume media MHB yang dibuat biasanya sebanyak 500 ml,
tergantung dari keinginan peneliti.

d. RPMI
Sudah siap pakai, tinggal sterilisasi saja (pindahkan kedalam labu erlenmeyer
kemudian tutup mulut labu dengan tutup, sekitar 100 mL saja dan masukan kedalam
autoklaf dan disterilisasi.

Catatan : Pembuatan media dengan kultur mikroba dilaksanakan dihari yang sama agar
menghindari media agar memadat seperti MHA, dan PDA dan masih bisa
dituang kedalam cawan petri.

4. Kultur Mikroba
Kultur mikroba dilakukan agar supaya mikroba dalam keadaan fase stasioner.
Langkah-langkahnya :
1. Nyalakan LAF (Laminar Air Flow) kemudian nyalakan Lampu UV selama kurang
lebih 15 menit.
2. Bersihkan meja LAF dan semprot dengan alkohol dan lap pakai tisu.Handscoon juga
semprot dengan alkohol 70 %
3. Nyalakan bunsen dan air flownya LAF.
4. Tuang media pertumbuhan (PDA dan MHA) kedalam cawan petri (1 cawan petri
untuk 1 bakteri, serta labeli terlebih dahulu cawan petri dengan nama bakteri) dan 1
tabung reaksi untuk media miring.
5. Tunggu hingga media MHA dan PDA memadat.
6. Ambil bakteri stock kemudian goreskan kedalam media yang baru. MHA/NA untuk
Bakteri, PDA untuk Jamur.
7. Cara menggores : untuk cawan petri bentuk huruf Z, sedangkan untuk Tabung reaksi
gores satu kali dari bawah sampai keatas.
8. Bungkus capet dan tabung reaksi dengan plastic wrap. Sebelumnya tabung reaksi
sudah ditutup mulut tabungnya.
9. Simpan dan inkubasi bakteri didalam inkubator selama 20 jam.
10. Kalau sudah 20 jam dan belum pengujian, simpan bakteri kultur kedalam kulkas
(bakteri akan dorman)
Catatan :
 Cara membuka tutup labu erlenmyer yaitu dijepit diantara jari manis dan
kelingking agar supaya tutup tetap steril , dan jangan letakan diatas meja
LAF. Biarkan tetap terjepit di jari selama menuang media.
 Semua penuangan media, penggoresan semua dilakukan didepan bunzen.

4
  Ingat untuk selalu membakar batang Ose selesai diguanakn dan celup
kedalam tabung reaksi berisi alkohol. Serta siapakan 1 tabung reaksi berisi
alkohol untuk mecuci jarum ose.

5. Pembuatan Standar Mc farland 0,5

Pembuatan Standar Mc Farland, langkah-langkah pembuatannya sebagai berikut :
a. Siapkan dua buah larutan yaitu : BaCl2 1,175% (0,05 mL) dan H2SO4 1% (9,95
mL) (buat dalam 40 mL , tinggal kali 4 volumenya masing” larutan)
b. Siapkan 1 buah tabung reaksi cefakor bersih
c. Ambil BaCl2 1,175% (0,05 mL x 4) masukan kedalam tabung reaksi cefakor
d. Ambil H2SO4 1% (9,95 mL x 4) masukan kedalam tabung reaksi , campur kedua
larutan dalam tabung reaksi cefakor.
e. Divorteks hingga homogen.
f. Didapatkan larutan standar 0,5 Mc Farland.
g. Pindahkan kedaam kuvet Spektro dengan menggunakan pipet tetes bersih.(volume
sesuaikan dengan kuvetnya)
h. Ukur absorbansi dengan spektrofotometer.(range absorbansi untuk mcfarland 0,5
yaitu = 0,08 – 0,1)  kalau suspensi bakteri masuk di range ini berarti kekeruhan
suspensi bakteri sudah sama dengan si standar Mc-farland.
i. Panjang gelombang untuk bakteri 625 nm, untuk fungi 450 nm. Kemudian catat
absorbansi keduannya.
j. Mc Farland hanya sekali dibuat, dapat digunakan seterusnya jika tidak mengendap,
kalau mengendap tinggal di vortex kembali.

6. Pembuatan Suspensi Mikroba

Catatan :
- Pengerjaan dilakukan di dalam LAF (wajib)
- Print Kertas Standar Mc Farland.
- KertasMc Farland hanya seperti garis seperti berikut, jadi Larutan Mcfarland yang
sudah jadi bandingkan dengan suspensi bakteri lihat kekeruhannya pada garis hitam
contohnya seperti di gambar dibawah

- Siapkan spuit 10 mL sebanyak mungkin (5 atau lebih)

- Siapkan ose dan bunzen serta tabung reaksi berisi alkohol untuk mencuci ose.

5
 - Siapkan tabung cefakor (mirip tabung reaksi berukuran agak lebih besar) yang sudah
di STERILISASI.
Langkah- langkahnya :
- Masukan NaCl Fisiologis 0,9 % kedalam tabung cefakor sebanyak 30 mL
- Ambil mikroba 1 goresan ose (jumlah bisa disesuaikan)
- Dicelupkan kedalam NaCl 0,9% , kemudian di vortex, vortex jangan terlalu kencang
agar bakteri tidak mati.
- Bandingkan kekeruhan suspensi dengan suspense standar Mc Farland 0,5
menggunakan kertas Mc Farland (disarankan untuk mengukur absrobansinya)
- Ukur absorbansi suspensi pindahkan kedalam kuvet bersih dengan pipet bersih.
Panjang gelombang yang digunakan untuk bakteri 625 nm dan jamur 450 nm
- range absorbansi untuk mcfarland 0,5 yaitu = 0,08 – 0,1)  kalau suspensi bakteri
masuk di range ini berarti kekeruhan suspensi bakteri sudah sama dengan si standar
Mc-farland.

7. Pembuatan Larutan Kontrol Positif (+)

Pembuatan kontrol positif harus dibuat pada hari pengujian.
Catatan :
- 1 mg kontrol positif itu untuk 3 microplate (karena di triplo) dan 1 sampel uji.
- Timbang kontrol positif sebelum hari pengujiian.
- Kontrol postif untuk bakteri kloramfenikol.
- Kontrol Positif untuk jamur adalah Nistatin (beli yang salut gula, dosis 100.000 IU)
- Biasanya saat penimbangan tidak sampai 1 mg, ini tidak apa-apa asal jangan lebih
dari 1,3 mg dan kurang dari 1 mg. catat berat masing-masing kontrol postif (sangat
berguna untuk pembuatan larutan).
- Semua pengerjaan dilakukan didalam LAF sterile.
- Siapkan Micropipet 1000 dan 100 dan rak pipet, beserta dengan tip-nya sebanyak
mungkin.
- Media yang digunakan sesuaikan dengan mikroba yang akan diujikan, MHB untuk
bakteri dan RPMI untuk fungi.
Langkah-langkahnya :
- Buat larutan stock kontrol (+), caranya :
- Ambil kontrol positif 1 mg (1000 μg) di tabung ependorf.
- Masukan 100 μL DMSO kedalam tabung eppendorf, yang sudah berisi kontrol positif
tadi kemudian di vortex.
- Tambahkan media MHB/RPMI sebanyak 900 μL divortex kembali, didapatkan
volume konsentrasi control positif (+) = (1000 μg/1mL) = 1000 ppm
- Selanjutnya dibuat larutan uji
- Larutan stock konsentrasi 1000 ppm diencerkan menjadi 512 ppm
- Cara pengenceran menggunakan rumus pengenceran : M1.V1=M2.V2
Cara : M1.V1=M2.V2
1000 ppm. V1 = 512 ppm . 800 μL

6
 (kenapa 800 μL? Karena 1 well pada plate volume maksimal itu volumenya
200 μL, karena di triplo kali 3 = 600 μL, agar supaya menghindari kekurangan,
dilebihkan volume larutan uji menjadi 800 μL.
512 𝑝𝑝𝑚 .800 𝜇𝐿
V1 = 1000 𝑝𝑝𝑚
V1 = 409,5  410 μL
- Kemudian ambil tabung ependorf baru kemudian labeli dengan namanya K(+) 512
ppm.
- Ambil 410 μL dari larutan stock masukan kedalam tabung eppendorf tadi
menggunakan micropipet.
- Tambahkan 390 μL media MHB/RPMI dan di vortex.
- Didapat lah larutan Kontrol Positif konsentrasi 512 μg/ mL volumenya 800 μL
- Tutup dan siap digunakan.
- Kalau berat Kontrol Positif lebih dari 1 mg,
- contoh seperti 1,5 mg, maka larutan stock dibuat seperti cara diatas (jika berat
control positif = 1 mg) namun konsentrasinya menjadi 1500 ppm,
- karena berat kontrol (+) = 1,5 mg atau 1500 μg jadi konsentrasi nya menjadi
1500 μg/mL (1500 ppm). Tinggal di encerkan saja dengan rumus pengenceran :
1500 ppm. V1 = 512 ppm . 800 μL
512 𝑝𝑝𝑚 .800 𝜇𝐿
V1 = 1500 𝑝𝑝𝑚
V1 = 273 μL (larutan stock 273 μL + 527 μL media MHB/RPMI)

8. Pembuatan Larutan Sampel Uji (Senyawa Isolat)

Pembuatan Sampel uji harus dibuat pada hari pengujian
Catatan :
- Pembuatan larutan Sampel uji sama dengan pembuatan larutan K(+), hanya yang
membedakan volumenya saja, kalo K(+) dibuat sebanyak 800 μL namun kalau
Sampel uji dibuat sebanyak 1500 μL.
-
Langkah-langkahnya :
- Buat larutan stock terlebih dahulu, caranya :
- Ambil Sampel uji 1 mg (1000 μg) di tabung ependorf. (yang sudah ditimbang
sebelumnya).
- Masukan 100 μL DMSO, kemudian di vortex.
- Tambahkan media MHB/RPMI sebanyak 900 μL divortex kembali, didapatkan
konsentrasi larutan stock sampel (1000 μg/1mL) = 1000 ppm
- Selanjutnya dibuat larutan uji
- Konsentrasi 1000 ppm selanjutnya diencerkan menjadi 512 ppm
- Cara pengenceran menggunakan rumus pengenceran : M1.V1=M2.V2
Cara : M1.V1=M2.V2
1000 ppm. V1 = 512 ppm . 1500 μL (kenapa dibuat dalam 1500 μL? Karena 1
well plate itu volume maksimalnya 200 μL dan ada 2 lubang untuk setiap
sampel jadi 400 μL , karena di triplo kali 3 (3 plate) = 1200 μL, untuk
menghindari kekurangan, dilebihkan menjadi 1500 μL)

7
 512 𝑝𝑝𝑚 .1500 𝜇𝐿
V1 = 1000 𝑝𝑝𝑚
V1 = 768μL

- Kemudian ambil tabung ependorf baru kemudian labeli dengan kode isolat senyawa
+ 512 ppm.
- Ambil 768 μL dari larutan stock masukan kedalam tabung eppendorf tadi.
- Tambahkan 732 μL media MHB/RPMI dan di vortex.
- Didapat larutan sampel uji dengan konsentrasi 512 μg/ mL volumenya 1500 μL
- Tutup dan siap digunakan.
- Ulangi langkah-langkah diatas untuk sampel uji atau senyawa isolat lainnya yang
akan di uji.

- Kalau berat SAMPEL UJI lebih dari 1 mg,

- CONTOH berat sampel uji seperti 1,5 mg tinggal buat saja larutan stock seperti cara
diatas (jika berat control positif = 1 mg)
- karena sampel uji= 1,5 mg atau 1500 μg jadi konsentrasi nya menjadi 1500
μg/mL (1500 ppm).
- Tinggal di encerkan saja dengan rumus pengenceran :
1500 ppm. V1 = 512 ppm . 800 μL

512 𝑝𝑝𝑚 .800 𝜇𝐿

V1 = 1500 𝑝𝑝𝑚

V1 = 273 μL

9. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif (-)

Kontrol negatif yang di gunakan yaitu DMSO 5,12 % kenapa harus 5,12 %? Karena
lebih dari 10 % DMSO mampu menghambat pertumbuhan bakteri.
Langkah-langkahnya
- hitung terlebih dahulu berapa well yang akan di isi dengan kontrol negatif beserta
dengan volumenya.
- Dalam pengujian ini terdapat 3 well ( 1 well/lubang untuk 1 microplate) dengan
volume 200 μL masing-masing well, karrena ada 3 maka volume total 600 μL,
dilebihkan sedikit volumenya menjadi 800 μL
5,12
- Maka 5,12 % dari 800 μL Berapa?? = x 800 μL = 41 μL
100
- Jadi ambil 41 μL DMSO masukan kedalam tabung Eppendorf baru yang sudah
dilabeli tutupnya K (-)
- Tambahkan 759 μL media cair MHB.
- Divortex hingga homogen.
- Tutup, dan siap digunakan.

8
 10. Penentuan MIC
Untuk pengerjaaan penentuan MIC, seharusnya langkah-langkah 1-9 sudah dilakukan
semua. Ingat Pengerjaan dilakukan didalam LAF. Semua alat yang digunakan selain
media disterilisasi dengan lampu UV-nya LAF (selama 15 menit).
Untuk Pengerjaan penentuan MIC dibagi menjadi 3 langkah :
a. Langkah Pertama
Masukan setiap larutan sesuai dengan template dibawah ini kedalam 96-well
microplate :
Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom Kolom kolom Kolom
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 1 A Sample 1 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 1 B Sample 1 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 2 C Sample 2 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 2 D Sample 2 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 3 E Sample 3 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Sample 3 F Sample 3 Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
Positive G Positive Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
(512 ppm) medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

200 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL 200 μL
DMSO
H DMSO Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth Broth
10% 5.12% medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium medium

Growt
h Sterility
contro control
l
Catatan :
Sampel 1 (senyawa isolat 1)
Sampel 2 (senyawa isolat 2)
Sampel 3 (senyawa isolat 3)
Kontrol positif
Kontrol negatif
Kontrol Pertumbuhann
Kontrol Sterilitas

9
 - Masukan terlebih dahulu setiap lubang selain kolom pertama (1) media cair
MHB/RPMI sebanyak 100 μL dan 200 μL untuk kolom kontrol sterilitas.
- Kemudian masukan sebanyak 200 μL untuk sampel A, B, C, control postif, dan
kontrol negative pada kolom 1. (ganti tip setiap ganti sampel untuk micropipet).

b. Langkah Kedua
- Ambil Micropipet multicahnel ukuran 200 μL.Ambil sebanyak 100 μL dari kolom 1
(pertama) (A-H)
- Pindahkan ke kolom kedua, kemudian pipet 4-6 kali (pipet usahakan tip tetap berada
dalam lubang dan menyentuh media)
- Ulangi langkah kedua untuk kolom ketiga sampai kolom ke 10
- Ketika sudah sampai di kolom ke 10, ambil 100 μL kemudian buang.
- Sekarang setiap lubang dari kolom 1-10 sudah mempunyai serial dilusi konsentrasi
dengan volume masing-masing 100 μL.
Catatan : setiap microplate yang berbeda, gunakan tip yang baru.
Konsentrasi Setiap well menjadi seperti berikut :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

A
1 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

B
1 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

C
2 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

D
2 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

E
3 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Sample 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

F
3 μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Growth Sterility

Positif G
μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL μg/mL control control

Growth Sterility
Negatif H 2.56% 1.28% 0.64% 0.32% 0.16% 0.08% 0.04% 0.02% 0.01% 0.005%
control control

c. Langkah Ketiga
- Siapkan sebuah micropipet multichanel ukuran 200 μL.
- Vortex suspensi bakteri yang akan digunakan
- Masukan suspensi bakteri dari tabung rekasi cefakor kedalam cawan petri steril.
(ingat cara buka tutup tabung).
- Ambil suspensi sebanyak 100 μL masukan ke lubang microplate dari kolom 1 sampai
kolom ke 11.

10
- Goyangkan microplate secara pelan dan perlahan (jangan teralu kencang agar tidak
tumpah)
- Siapkan Ice-box yang berisi es batu.
- Masukan microplate kedalamnya untuk pengukuran microplate reader (dilakukan
agar tidak ada pertumbuhan mikroba).
- Ukur absorbansi setiap microplate dengan Microplate reader. (Cara pengukuran
bertanya laboran dilab)
- Inkubasi microplate dalam inkubator selama 20 jam untuk bakteri, sedangkan untuk
jamur 2x 20 jam pada suhu 35 ± 2 °C.
- Setelah inkubasi ukur kembali absorbansi dengan alat microplate reader/ELISA.

11
11. Alat dan Bahan
ALAT :
- Cawan Petri (10)
- Tabung reaksi (5)
- Tabung reaksi Cefakor (5)
- 96-well microplate (9 atau lebih)
- Tabung eppendorf (sebanyak-bannyaknya)
- Micropipet singlechannel 1000 μL (2)
- Micropipet single channel 300 μL (2)
- Micropipet single channel 200 μL (2)
- Micropipet multi channel 200 μL (2)
- Rak Micropipet (1).
- Tip mikropipet 1000, 200 (sebanyak-banyaknya)
- Tempat Tip mikropipet (2)
- Spuit 10 mL (3)
- Masker
- Handscoon (sebanyak-banyaknya)
- Bunsen (2)
- Ose (2)
- Botol Spray Berisi Alkohol (Botol Kispray juga bisa) (1)
- Rak tabung eppendorf (3)
- Vortex (1)
- Hotplate (1) dan Magnetik Stirer nya
- Timbangan anallitik. (1)
- Sendok Isolat
- Sendok tanduk
- Botol vial (1)
- Botol gelap ukuran 100 mL
- Labu Erlenmyer 500 mL (1)
- Labu Erlenmeyer 250 mL (2)
- Autoklaf
- Laminar Air Flow
- Microplate reader
- Spektrofotometer UV
- Kuvet
- Kertas Mc Farlan d
- Kulkas (lemari pendingin)
- Inkubator Bakteri
- Ice Box

12
Bahan :
- Bakteri-bakteri dan fungi Uji
- Media MHA
- Media MHB
- Media PDA
- Media RPMI
- Aquadest 1000 mL
- Kapas
- Kain Kasa
- NaCl 0,9% (1)
- Sampel uji/senyawa isolat (1mg , masing-masing)
- BaCl2 1,175% (0,05 x 4 mL)
- H2SO4 1% (9,95 x 4 mL)
- Tissue (1000 gram)
- Label (wajib)
- Kertas bekas sisa-sisa konsul laporan/proposal (untuk bungkus capet) (sebanyak-
banyaknya)
- Sabun sungliight (1L)
- Alkohol 96/70 % (1L)
- Es batu

13