II. Prinsip
2.1 Uji Biokimia
Yaitu dengan perlakuan atau cara yang dapat dilakukan dalam proses
identifikasi serta determinasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi yang
didapat melalui sifat fisiologinya. Proses ini berkaitan dengan metabolisme
pada sel yaitu reaksi secara kimiawi yang dilakukan sel untuk menghasilkan
energi yang digunakan pada sisntesis komponen-komponen sel. Selain itu,
dapat digunakan untuk kegiatan selular seperti pergerakan sel (Hadiutomo,
1990).
4.2 Bahan
a. Aquadest steril
b. Dimetil Sulfoksida
c. Ketokonazol
d. Kloramfenikol
e. Mueller-Hinton Agar
f. Sabouraud Dextrose Agar
g. Sampel ekstrak
h. Sampel sediaan suspensi ekstrak
V. Data Pengamatan
5.1 Pembuatan Larutan dan Pengenceran Ekstrak
No Perlakuan Hasil Foto
1. Ditimbang ekstrak ekstrak kental
kental sampel sampel telah
sebanyak 0,5 g ditimbang
dalam kaca arloji sebanyak 0,5174 g
dalam kaca arloji
4. Dituangkan ke 50 µl larutan
dalam cawan petri ekstrak berada pada
yang berisi MHA cawan petri MHA,
atau PDA PDA
5. Diratakan dengan Larutan ekstrak
menggunakan tersebar merata
spreader
5.4 Uji Angka Lempeng Total dan Angka Kapang Khamir Suspensi
Ekstrak
No Perlakuan Hasil Gambar
1. Diambil 50 µl 50 µl
kloramfenikol dan kloramfenikol
dituang ke dalam berada pada cawan
cawan petri PDA, petri berisi PDA,
50 µl ketokonazol 50 µl ketokonazol
dan dituang ke berada pada cawan
dalam cawan petri petri berisi MHA
MHA (Masing-
masing 6 cawan
petri)
2. Disebar dengan Kloramfenikol dan
menggunakan ketokonazol
spreader dan tersebar merata dan
tunggu hingga kering
kering
4. Dituangkan ke 50 µl suspensi
dalam cawan petri ekstrak berada pada
yang berisi MHA cawan petri MHA,
atau PDA PDA
VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian Angka Lempeng Total
(ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK) suspensi ekstrak dan sediaan yang
akan dibuat dengan tujuan untuk menghitung jumlah koloni bakteri, kapang dan
khamir dengan metode penumbuhan mikroorganisme pada media tertentu.
Seharusnya pada pengujian ini, bakteri dan jamur yang ditemukan berjumlah
sedikit karena baik ekstrak maupun sediaan akan dikonsumsi. Suatu sediaan
dikatakan aman apabila Angka Lempeng Total nya kurang dari 106 CFU/mL.
Hal ini termasuk dalam persyaratan mutu suatu sediaan obat yang baik.
Bahan yang digunakan dalam pengujian ini diantaranya ekstrak daun jati
belanda yang merupakan zat aktif dan sediaan yang telah jadi dan siap diuji,
kemudian digunakan larutan dimetil sulfoksida (DMSO) 2 mL untuk
meningkatkan kelarutan dan ditambahkan dengan aquadest.
Uji Angka Lempeng Total dan Angka Kapang Khamir menggunakan
teknik cawan sebar. Sebelum dilakukan uji ini, pertama ekstrak yang telah
dilarutkan dalam dimetil sulfoksida diencerkan secara bertingkat, tujuan nya
untuk mengurangi kepekatan bakteri yang akan ditanam dengan menambahkan
pelarut yang bersifat netral yaitu dengan aquadest steril. Pada uji Angka
Kapang Khamir, ditambahkan antibiotik kloramfenikol pada cawan petri,
bertujuan untuk mencegah tumbuhnya bakteri pada media. Sedangkan pada Uji
Angka Lempeng Total ditambahkan antifungi ketokonazol agar mencegah
tumbuhnya jamur pada media yang digunakan. Pembuatan larutan uji dengan
aquadest steril dilakukan dengan cara pengenceran sampai konsentrasi 10-6 agar
hasil yang baik dapat dibandingkan pada tiap konsentrasinya.
Selanjutnya, dari masing-masing suspensi ekstrak tersebut dilakukan
inokulasi dengan cara memipet 100 µL suspensi bakteri ke dalam media SDA
(Sabouraud Dextrose Agar) untuk pengujian AKK dan MHA (Mueller Hinton
Agar) untuk pengujian ALT. Lalu diletakkan pada permukaan medium agar lalu
disebar dengan menggunakan spreader steril. Selain itu, digunakan etanol 70%
untuk mensterilkan alat–alat yang digunakan seperti pada alat spreader supaya
terhindar dari kontaminasi cemaran mikroorganisme lain.
Proses penyebaran ini harus dilakukan secara merata dan harus aseptis
sehingga dapat terhindar dari penumpukan konsentrasi bakteri yang tumbuh
pada bagian tertentu saja. Teknis aseptis juga dilakukan untuk mencegah
tumbuhnya bakteri yang dapat mengkontaminasi pada proses pengujian.
Pada proses inokulasi diperlukan proses fiksasi dengan menggunakan
pembakar spritus. Hal ini bertujuan agar tidak terjadi kontaminan baik pada saat
inokulasi atau pada mulut cawan petri, karena bakteri adalah organisme yang
tidak tahan terhadap pemanasan atau suhu tinggi sehingga proses fiksasi sangat
membantu yaitu dengan cara didekatkan pada sumber panas. Setelah suspensi
telah disebar di atas permukaan media agar, dilakukan inkubasi selama lebih
kurang 2-5 hari untuk pengujian AKK pada suhu 20-25oC dan 18 jam untuk
pengujian ALT pada suhu 35oC. Bakteri dalam uji ini dapat hidup optimum
pada suhu tersebut, sehingga hasil pengujian akan lebih terlihat dan akurat.
Media uji diinkubasi dalam posisi cawan petri media terbalik, hal ini
bertujuan agar uap yang mengembun dalam tutup cawan petri tidak menetes
dalam media. Jika uap air itu menetes dalam media maka akan terjadi
kontaminasi pada bakteri/fungi dalam media. Karena air merupakan medium
yang baik untuk pertumbuhan bakteri dan fungi
Hasil yang didapat pada pengujian ALT adalah terdapat cemaran berupa
jamur yang tumbuh karena inkubator terkontaminasi sehingga bakteri yang
akan diamati tidak ditemukan dan tidak dapat dilakukan perhitungan ALT
karena tidak memenuhi syarat perhitungan ALT, dimana perhitungan ALT
dapat dilakukan jika mikroba memiliki rentang antara 30-300 koloni.
Sedangkan pada pengujian Angka Kapang Khamir (AKK) diperoleh
cemaran jamur dengan variasi jenis yang beragam, ada yang berhifa ataupun
tidak. Jumlah cemaran yang digunakan diambil dari jumlah cemaran kapang
khamir pada pengenceran ke 10-4 dan 10-5 dengan hasil rata-rata cemaran
sebesar 112 x 103/0,5 mL sediaan atau 224 x 103/mL sediaan. Hasil ini tidak
sesuai dengan persyaratan sediaan Obat Herbal Terstandar dimana batas
maksimal cemaran Kapang-Khamir adalah tidak lebih dari 103 koloni/mL
sediaan.
VII. Kesimpulan
Pengujian Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir
(AKK) pada sampel ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk) dan
sediaan Guazuspen telah dilakukan, nilai Angka Lempeng Total (ALT) tidak
dapat dilakukan perhitungan karena tidak memenuhi persyaratan, sedangkan
nilai Angka Kapang Khamir (AKK) didapatkan hasil rata-rata cemaran
sebesar 112 x 103/0,5 mL sediaan atau 224 x 103/mL sediaan, hasil ini tidak
sesuai dengan persayaratan sediaan Obat Herbal Terstandar dimana batas
maksimal cemaran Kapang-Khamir tidak lebih dari 103 koloni/mL sediaan.
Daftar Pustaka
Atlas, R.M. 2000. Handbook of Microbiological Media, 2nd edition. New York: CRC
Press.
Atma, Yoni. 2016. Angka Lempeng Total (ALT), Angka Paling Mungkin (APM) dan
Total Kapang Khamir Sebagai Metode Analisis Sederhana Untuk Menentukan
Standar Mikrobiologi Pangan Olahan Posdaya. Jurnal Teknologi. Vol 8 No 2.
BPOM, 2006, Metode Analisis PPOMN, MA PPOMN nomor 96/mik/00, Uji Angka
Kapang/Khamir dalam Obat Tradisional. Jakarta: BPOM pp.108-110
Getas, I Wayan., Ida Bagus Rai Wiadnya., Luh Aprisa Waguriani. 2014. Pengaruh
Penambahan Glukosa Dan Waktu Inkubasi Pada Media Sda (Sabaroud
Dextrose Agar) Terhadap Pertumbuhan Jamur Candida Albicans. Media Bina
Ilmiah 51. Volume 8 (1): 1978-3787.
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratotium Edisi 1. Jakarta: PT Garfindo
Persada.
Maturin L, Peeler JT. 2001. Aerobic Plate Count. In: Bacteriological Analytical
Manual Online. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Washington
DC: US Food and Drug Administration.
Pinki Prahara T., Meitini.W.P., Irsan Nuhantoro. 2015. Pengaruh Media terhdap
Pertumbuhan dan Biomassa Cendawan Alternaria Alternata Keissler. Jurnal
Biologi. Vol 19 (1).
Radji, M. 2011. Buku Ajar Panduan Mikrobiologi Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran. Jakarta: Buku Kedokteran EGC.
Tarigan, J. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan
Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan.
Lampiran
• Pengenceran Ekstrak Guazumae ulmifolia L.
0,5 𝑔𝑟𝑎𝑚
Larutan stock = = 10-1
5 𝑚𝑙
Rumus pengenceran: N1 x V1 = N2 x V2
1. Pengenceran ke- 1
10-1 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-1 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-2
2. Pengenceran ke -2
10-2 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-2 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-3
3. Pengenceran ke -3
10-3 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-3 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-4
4. Pengenceran ke -4
10-4 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-4 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-5
5. Pengenceran ke -5
10-5 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-5 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-6
• Pengenceran Sediaan Suspensi Guazumae ulmifolia
0,5 𝑚𝑙
Larutan awal: = 10−1
5 𝑚𝑙
Rumus pengenceran: N1 x V1 = N2 x V2
1. Pengenceran ke- 1
10-1 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-1 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-2
2. Pengenceran ke -2
10-2 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-2 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-3
3. Pengenceran ke -3
10-3 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-3 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-4
4. Pengenceran ke -4
10-4 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-4 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-5
5. Pengenceran ke -5
10-5 x 0,5 ml = N2 x (0,5 ml + 4,5 ml)
10-5 x 0,5 ml = N2 x 5 mL
N2 = 10-6
• Perhitungan ALT Ekstrak Guazumae ulmifolia L.
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
<1 <1 <1 <1 <1 <1
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan didapatkan cemaran
berupa jamur yang tumbuh karena media yang digunakan telah rusak
sedangkan jumlah koloni bakteri tidak ditemukan, sehingga perhitungan ALT
tidak dapat dilakukan karena tidak memenuhi syarat perhitungan Angka
Lempeng Total (ALT). Dimana perhitungan ALT dapat dilakukan jika
mikroba yang didapat dalam rentang 30-300 koloni.
AKK = 80 koloni
• Pengenceran 10-2
1
AKK = 6 x 10−2
Sehingga di dapat dalam 1 ml banyaknya jumlah koloni adalah 224 x 103 / ml.