BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Pada Desain eksperimental ini digunakan pada uji antibakteri ini adalah penelitian

dengan analisis ekstrak cincai hijau (cocculus orbiculatus) terhadap respon hambat

minimum bakteri escherichia coli dengan menggunakan dengan metode difusi.

3.2 Kerangka Konsep

Variabel Independen Variabel Depeneden

Konsentrasi ekstrak cincau hijau Efektivitas antibakteri ekstrak cincau

(cocculus orbiculatus ) 25%, 50%, hijau (cocculus orbiculatus )
75% dan 100% terhadap Escherichia Coli

Bagan 3.2 Kerangka Konsep

3.3 Populasi
Tanaman cincau hijau (cocullus orbiculatus) yang tersebar dikota Palembang

Sumatera Selatan.

3.4 Sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah cincau hijau (cocculus orbiculatus )

yang diperoleh dari kota prabumulih Sumatera Selatan.

3.5 Variabel Penelitian

3.5.1 Variabel Independen

Variabel Independen pada penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak cincau

hijau (cocculus orbiculatus) pada konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%.
 3.5.2 Variabel Dependen

Variabel Dependen Pada penelitian ini adalah konsentrasi hambat minimum

bakteri Escherichia coli oleh ekstrak cincau hijau (cocculus orbiculatus).

3.6 Waktu dan tempat penelitian

3.6.1 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan DI Laboraturium Mikrobiologi Farmasi STIK Siti

Khadijah Palembang.

3.6.2 Waktu Penelitian

Waktu penelitian dilakukan pada Bulan

3.7 Instrumen Penilitian

3.7.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian adalah blender, timbangan digital,

toples kaca gelap untuk maserasi, batang pengaduk, pipet tetes, pinset, gelas ukur,

gelas beker, tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, incubator,

autoclave, rotary evaporator, penjepit tabung reaksi, lampu spiritus, korek api,

kapas, alumunium foil, spidol, jangka sorong, kamera, mikropipet, pipet ukur.

3.7.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah cincai hijau (cocculus

orbiculatus), dari kota prabumulih, bakteri Escherichia Coli, etanol 96%,

amoniak, kloroform, H2SO4 0,3 N, BaCl2, reagen dragendrof, NaOH, Asam

sulfat pekat, MgHCL, Asam Clorida, pereaksi Lieberman-Burchard, Nutrient

Agar (NA), Alkohol, Aquadest, paper disk dan Cotrimokazol.

 3.7.3 Pembuatan Konsentrasi larutan uji

Pembuatan larutan uji ekstrak etanol daun cincau hijau diencerkan secara

berseri dengan konsentrasi 25 persen, 50persen, 75 persen, dan 100 persen untuk

KBM, dengan perhitungan sebagai berikut :

1. 25 persen = 25/100x10 ml= 2,5 gr

2. 50 persen = 50/100x10 ml= 5 gr

3. 75 persen = 75/100x10 ml= 7.5 gr

4. 100 persen = 100/100x10 ml = 10 gr

Tabel 3.7.3 Pembuatan konsentrasi larutan

Konsentrasi Ekstrak Aquadest

25% 2,5 gr 10 ml

50% 5 gr 10 ml

75% 7,5gr 10 ml

100% 10 gr 10 ml

3.8 Skrining Fitokimia

a. Identifikasi Alkaloid

Ekstrak sebanyak 2 ml dilarutkan dalam 2 ml asam klorida, dipanaskan 5 menit dan

disaring. Filtrat yang diperoleh ditambah 2-3 tetes perekasi Dragendrof. Adanya

senyawa alkaloid ditunjukkan dengan endapan jingga (Hanani, 2017).

b. Identifikasi Flavonoid

Ekstrak sebanyak 2 ml sampel dilarutkan dalam 2 ml metanol, kemudian ditambahkan

serbuk Mg dan HCL pekat sebanyak 5 tetes. Adanya senyawa flavonoid ditunjukkan

denga terbentuknya warna merah atau jingga (Hanani, 2017).

c. Identifikasi Saponin

Ekstrak Saponin 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml air panas, di

dinginkan dan kemudian dikocok selama 10 detik. Hasil yang positif dengan

terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, pada penambahan

asam klorida 2 N buih tidak hilang (Hanani, 2017)

d. Identifikasi Steroid atau Triterpenoid

Ekstrak 500 mg ditambahkan etanol 96 persen 2 ml ditambahkan 2 ml kloroform dan 2

ml H2SO4 yang ditambahkan pada dinding tabung reaksi. Terbentuknya cincin warna

merah menunjukkan adanya steroid (Hapsari, 2017).

e. Identifikasi Tanin

Ekstrak sebanyak 500 mg ditambahkan etanol 96 persen 2 ml kemudia. Diteteskan

FeCl3 3 tetes dan akan terbentuk warna biru, biru-kehijauan, biru-hijau endapan.

Perubahan warna dapat terjadi karena adanya reaksi antara senyawa hidroksil pada

tanin dengan pereaksi (Hanani, 2017).

f. Identifikasi Minyak Atsiri

Dilakukan Ekstrak Sebanyak 1 ml ditambahkan larutan Kalium permanganat, warna

akan terjadi pucat atau hilang ketika dipanaskan akan mengeluarkan bau khas minyak

atsiri (Hanani, 2017).

 g. Identifikasi Glikosida

Sebanyak 0,1 ml larutan uji diuapkan diatas penangas air, larutkan sisa dalam 5 ml

asam asetat anhidrat P. Tambahkan 10 tetes asam sulfat P terjadi warna biru atau hijau,

menunjukkan adanya glikosida. (Hanani, 2017).

3.9 Pembuatan Larutan Positif Cotrimoxazol

Serbuk Cotrimoxazol dilarutkan dengan aquadest hingga 10 ml diperoleh konsentrasi 1

%.

1 % = 10/100x10=1 gr

Serbuk Cotrimoxazol ditimbang 1 gram lalu ad 10 ml aquadest.

3.10 Sterilisasi Alat

Sterilisasi Alat dilakukan sebelum semua peralatan digunakan, yaitu dengan cara

disterilkan dalam oven untuk alat-alat yang terbuat dari kaca atau logam yang memiliki

tingkat skala atau keakuratan tinggi dengan suhu 180 derajat celcius selama 24 jam,

sterilkan alat-alat yang terbuat dari kaca yang memiliki tingkat keakuratan atau plastik

dalam autoklaf dengan suhu 121 derajat celcius selama 10-20 menit sedangkan untuk alat

yang tidak tahan panas tinggi disterilkan menggunakan alkohol.

3.11 Pembuatan Media

1. Nutrient Agar (NA)

Timbang sebanyak 2,8 gram serbuk Nutrient Agar (siap pakai), larutkan dalam 100 ml

aquadeat lalu panaskan sampai mendidih dan larut seluruhnya. Kemudian disterilkan

dalam autoclaf pada suhu 121 derajat celcius dan selama 15-20 menit. Media Nutrient

agar dituang sebanyak 20 ml kedalam cawan petri dan 10 ml kedalam tabung reaksi

untuk media agar miring, biarkan memadat, dan disimpan dalam lemari pendingin.
 2. Pembuatan Standar Mac.Farland

Larutan H2SO4 1 persen sebanyak 99,5 ml dicampurkan dengan larutan BaCl2

1persen sebanyak 0,5ml dalam erlemeyer, Kemudian dikocok sampai terbentuk

larutan yang keruh. Kekeruhan Ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri

uji.

3. Peremajaan Bakteri

Bakteri yang telah dimurnikan diinokulasi dengan bantuan jarum ose kemedia agar,

kemudian diinkubasikan pada suhu 37 derajat C selama 24-48 jam hingga diperoleh

pertumbuhan yang normal.

4. Pembuatan Suspensi Bakteri

Biakan bakteri disubkultur dalam media Nutrient agar diinkubasikan pada suhu 37

derajat celcius selama 24 jam. Hasil subkultur biakan bakteri diambil dengan jarum

ose dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan Nacl 0,9.

Setelah itu di homogenkan dengan cara divoteks dan disamakan kekeruhannya dengan

standar Mac.Farland 0,5 sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10

CFU/ml.

3.12 Metode Pengolahan dan Analisis Data

3.12.1 Metode Uji Efektivitas Antibakteri

Metode Difusi

1. Dituangkan media nutrient agar (NA) yang masih cair sebanyak 10 ml

(ketebalan 4-5 cm) kedalam cawan petri yang steril dan biarkan memadat.
 2. Ambil suspensi bakteri sebanyak 1 ml kemudian masukkan kedalam cawan

petri yang berisi media nutrient agar lalu di homogenkan dengan sprider dan

didiamkan hingga memadat

3. Secara Aseptik, letakkan kertas cakram yang telah direndam ekstrak dengan

konsentrasi 25, 50, 75, dan 100 dengan jarak tertentu.

4. Sebagai kontrol positif cakram kertas direndam dalam antibiotik dan sebagai

kontrol negatif direndam dengan aquadest .

5. Inkubasi cawan petri yang telah diberi perlakuan pada suhu 37derajat celcius
selama 24 jam. Kemudian diukur diameter zona bening (clear zone) yang
terbentuk disekitar kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong..

3.13 Metode pengumpulan data

Data-data digunakan pada penelitian ini adalah primer. yaitu Data yang diperoleh dari

hasil penelitian eksperimental di Laboraturium Mikrobiologi STIK Siti Khadijah

Palembang dan data sekunder, yaitu data yang diperoleh selain data pada hasil penelitian,

keperpustakaan dan skripsi yang berkaitan dengan penelitian.

3.14 Analisi Data

Untuk mengetahui data tersebut maka data yang diperoleh dianalisis dengan

menggunakan program statistika SPSS, dan beda nyata antara perlakuan uji dengan one

way ANOVA. One way ANOVA adalah analisi yang menggunakan varians dan

pengamatan yang digunakan untuk mengetahui hubungan dan besar resiko (Odd

ratio/OR) variabel bebas dengan terikan secara sendiri-sendiri dengan uji One way

ANOVA sehingga diperoleh nilai p value, 95 persen CL dan OR.

3.1.5 Defenisi Operasional

Tabel 3.15.1 Defenisi Operasional

Variabel Defenisi Alat Ukur Cara Ukur Hasil Skala

Ukur
Independen

Efektivitas Efektivitas Jangka Observasi / Diameter Rasio

Antibakteri antibakteri Sorong Pengamatan ukur zona

Escherichia dapat dilihat benig

Coli dengan dengan mm

pernghambatan

pertumbuhan

bakteri

Escherichia

Coli

Variabel Defenisi Alat Ukur Cara Ukur Hasil Skala

Ukur
Dependen

Konsentrasi Kadar ekstrak 25% Observasi / Ukur Ordinal

cincau hijau
Ekstrak 50% pengamatan konsentrasi
(cocculus
etanol orbiculatus) 75%
dengan metode
cincau hijau 100%
maserasi
(cocculus dengan pelarut
96% diperoleh
orbiculatus)
dengan
dijadikan
serbuk halus
 dahulu

3.16 Alur Pembuatan Simplisia

Pembuatan simplisia cincau hijau (cocculus orbiculatus)