BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan dan Desain Penelitian

Penelitian dilakukan dengan menggunakan rancangan eksperimental

laboratoris untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol bawang putih (Allium

sativum) terhadap pembentukan biofilm Staphylococcus aureus. Desain

penelitian ini adalah post-test only control group design dengan menggunakan

metode tube test.

Kelompok kontrol adalah kelompok yang tidak mendapat perlakuan

berupa pemberian ekstrak. Kelompok perlakuan adalah kelompok yang

mendapat perlakuan berupa pemberian ekstrak dengan dosis 5%, 10%, 15%,

20%, dan 25%.

4.2 Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi dari penelitian ini adalah bakteri Staphylococcus aureus. Sampel

penelitian ini adalah bakteri Staphylococcus aureus pembentuk biofilm isolat

swab tenggorok stok kultur Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya.

4.2.1 Pengulangan
 Pada penelitian ini digunakan sampel Staphylococcus aureus pembentuk

biofilm. Rumus untuk menghitung estimasi jumlah pengulangan adalah:

(p-1)(n-1) > 15

(6-1)(n-1) > 15

5n-5 > 15

5n > 20

n > 4

Keterangan:

p: jumlah perlakuan dosis ekstrak etanol bawang putih sebesar 0% (kontrol), 5%,

10%, 15%, 20%, 25%

n: jumlah pengulangan

Berdasarkan rumus, hasil pengulangan dilakukan sebanyak minimal 4 kali

pengulangan.

4.3 Tempat dan Waktu Penelitian

Pembuatan ekstrak etanol bawang putih dan uji penghambat biofilm

Staphylococcus aureus dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dari bulan Juli 2018 sampai dengan

Agustus 2018.
4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas penelitian adalah konsentrasi ekstrak etanol bawang

putih. Dalam penelitian ini digunakan konsentrasi 5%, 10%, 15%, 20%, 25%

berdasarkan uji eksplorasi yang dilakukan sebelum penelitian.

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah pembentukan biofilm dari

Staphylococcus aureus yang dapat dihitung dengan menggunakan

spektrofotometer.

4.5 Definisi Operasional

1. Staphylococcus aureus tergolong dalam bakteri gram positif yang

berbentuk kokus, bergerombol seperti buah anggur, bersifat anaerob

fakultatif, hasil tes menunjukkan katalase positif dan koagulase positif,

membentuk koloni berwarna kuning emas pada Nutrient Agar Plate.

Staphylococcus aureus yang dipakai di penelitian ini adalah

Staphylococcus aureus galur pembentuk biofilm yang diidentifikasi

dengan menggunakan metode tube test dan diambil dari isolat swab

tenggorok stok kultur Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya

2. Bakteri pembentuk biofilm yaitu bakteri yang mempunyai kemampuan

untuk menghasilkan sebuah multilayer biofilm yang tertanam pada lapisan

 glycocalyx yang terutama terdiri dari teichoic acid sehingga bakteri dapat

bertahan hingga 1000x lipat.

3. Biofilm adalah suatu produk dari bakteri yang membentuk lapisan padat

pada permukaan suatu substrat/ media. Pada penelitian ini,

penghambatan pembentukan biofilm akan diuji dengan metode tube test.

4. Ekstrak etanol bawang putih adalah hasil ekstraksi cair bawang putih

dengan pelarut etanol. Bawang putih yang digunakan sebanyak 250 gram

yang kemudian dihaluskan menjadi 100 gram bubuk bawang putih yang

selanjutnya akan diekstrak. Ekstrak yang didapat dianggap memiliki

kandungan ekstrak sebesar 100%.

5. Metode tube test atau metode tabung adalah metode deteksi biofilm

dengan menggunakan tabung sebagai media.

6. Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC) adalah konsentrasi

ekstrak etanol bawang putih terendah yang mampu menghambat

pembentukan biofilm Staphylococcus aureus yang ditandai dengan tidak

tampaknya bentukan cincin dan lapisan ungu kebiruan pada dinding

dasar tabung.

7. Mean Gray Value adalah skala intensitas warna pada program Adobe

Photoshop Creative Suite 3. Skala berkisar antara 0-255. Angka

mendekati 0 menunjukkan kepekatan warna yang tinggi. Sebaliknya,

angka mendekati 255 menunjukkan kepekatan warna yang rendah.

4.6 Instrumen Penelitian (Bahan dan Alat)

4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Etanol Bawang Putih (Allium

sativum)

1. Bawang Putih

2. Pelarut Etanol 96%

3. Vacuum oven atau drying oven

4. Blender/penumbuk

5. Rotatory evaporator

6. Kertas saring

7. Tabung pendingin

8. Pemanas aquades

9. Labu penampung (collection flask) berukuran 250 mL

10. Evaporator dengan vakum

11. Cawan penguap

4.6.2 Alat dan Bahan Identifikasi Bakteri

1. Isolat Staphylococcus aureus

2. Natrium Agar Plate (NAP)

3. Bahan Tes Katalase : H2O2 3%

4. Bahan Tes Koagulase : plasma darah dengan EDTA

5. Bahan pengecatan Gram : kristal violet, lugol, alkohol 96%, dan safranin
 6. Minyak imersi, ose, dan mikroskop

7. Lampu spiritus

8. Tabung reaksi

4.6.2 Alat dan Bahan Identifikasi Biofilm

1. Tryticase Soy Broth (TSB) dengan 1% glukosa (TSBglu)

2. Biakan Staphylococcus aureus pembentuk biofilm

3. Tabung reaksi

4. Phosphate Buffer Saline (PBS) PH 7,3

5. Kristal violet

6. Deionized water

7. Ose

8. Pipet

9. Beaker glass

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Persiapan Bawang Putih (Allium sativum)

4.7.1.1 Ekstraksi dan Evaporasi

- Bawang putih dicuci dari kotoran, tiriskan, keringkan, selanjutnya

ditimbang
- Keringkan dengan menggunakan oven biasa beberapa jam dengan suhu

50o-70oC

- Bawang putih diblender menjadi bubuk lalu ditimbang dalam neraca

analitik seberat 100 gram

- Bungkus menggunakan kertas saring dan direndam dalam etanol 96%

selama semalam. Etanol 96% yang digunakan untuk merendam diganti

beberapa kali sampai air ekstrak jernih. Kemudian hasil ekstraksi siap

untuk dievaporasi

- Evaporator set dipasang pada tiang permanen agar dapat digantung

dengan kemiringan 30o-40o terhadap meja dengan susunan dari bawah

ke atas alat pemanas air, labu penampung hasil evaporasi, rotatory

evaporator dan tabung pendingin. Kemudian tabung pendingin

dihubungkan dengan pompa sirkulasi air dingin yang terhubung dengan

bak penampung air dingin melalui pipa plastik. Tabung pendingin juga

terhubung dengan pompa vakum dan penampung hasil penguapan.

- Hasil ekstraksi dimasukkan dalam labu penampung sedangkan rotatory

evaporator, alat pompa sirkulasi air dingin, dan alat pompa vakum

dinyalakan. Pemanas aquades juga dinyalakan pada suhu 65oC (titik didih

etanol) sehingga hasil ekstraksi dalam tabung penampung evaporasi

mendidih dan etanol mulai menguap.

- Hasil penguapan etanol dikondensasikan menuju labu penampung etanol

sehingga tidak tercampur hasil evaporasi dan uap lain tersedot pompa

vakum.
 - Proses evaporasi dilakukan hingga volume hasil ekstraksi berkurang dan

menjadi kental. Setelah kental evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi

diambil. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian

dioven selama 2 jam pada suhu 40o-50o C untuk menguapkan pelarut

yang tersisa sehingga didapatkan hasil ekstrak 100%.

4.7.2 Persiapan Bakteri Staphylococcus aureus Pembentuk Biofilm

4.7.2.1 Identifikasi Staphylococcus aureus

A. Pemeriksaan Mikroskopis (Forbes et al, 2007)

1. Pembuatan sediaan slide

Membersihkan gelas objek dengan kapas, kemudian lewatkan di

atas api untuk menghilangkan lemak atau pencemar lain. Biarkan

dingin. Buatlah sediaan sedemikian rupa, sehingga tidak terlalu

tebal dan tidak terlalu tipis dengan cara:

- Teteskan satu ose aquades steril pada gelas objek. Ambil

sedikit biakan kuman menggunakan ose, selanjutnya

suspensikan dengan aquades pada gelas objek dan ratakan.

Untuk sediaan cair tidak perlu disuspensikan dengan aquades.

- Biarkan sediaan kering di udara, kemudian lakukan fiksasi

dengan cara melewatkan sediaan di atas api satu atau dua

kali.
2. Pewarnaan Gram

- Tuang sediaan pada gelas objek dengan kristal violet selama 1

menit. Buang sisa kristal violet dan bilas dengan air.

- Tuang sediaan dengan lugol selama 1 menit. Buang sisa lugol

dan bilas dengan air.

- Tuang sediaan dengan alkohol 96% selama 5-10 detik atau

sampai warna cat luntur. Buang sisa alkohol dan bilas dengan

air.

- Tuang sediaan dengan safranin selama ½ menit. Buang sisa

safranin dan bilas dengan air

- Keringkan sediaan dengan kertas penghisap

- Lihat di bawah mikroskop dengan lensa objektif perbesaran

1000x

B. Tes Katalase (Health Protection Agency, 2010)

- Tuangkan 0,2 mL H2O2 3% ke dalam tabung reaksi

- Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose

- Usapkan ose pada dinding tabung di atas permukaan cairan

- Tutup tabung reaksi, lalu goyangkan agar cairan H2O2 3%

dapat mengenai usapan biakan bakteri

- Amati pembentukan gelembung dalam waktu 10 detik

Hasil positif bila ada gelembung

 Hasil negatif bila tidak ada gelembung

Hasil positif menunjukkan Staphylococcus sp.

Hasil negatif menunjukkan Staphylococcus sp.

C. Tes Koagulase/ Slide Test (Forbes et al, 2007)

- Teteskan satu ose plasma darah dengan EDTA pada gelas

objek yang kering & bersih (gelas objek A)

- Teteskan air distilasi / air salin sebagai kontrol pada gelas

objek B

- Ambil sedikit biakan kuman dengan ose. Buat suspensi

dengan masing-masing gelas objek dan diratakan perlahan

selama 5-10 detik

Hasil positif bila terjadi penggumpalan dalam waktu 10

detik atau kurang pada gelas objek A dan tidak ada

penggumpalan pada gelas objek B.

Hasil negatif bila tidak ada penggumpalan pada kedua

gelas objek.

Hasil positif menunjukkan Staphylococcus aureus.

Hasil negatif menunjukkan Staphylococcus koagulase

negatif.
4.7.2.2 Pembentukan Perbenihan Cair Bakteri

Staphylococcus aureus yang sudah ditanam dalam medium Nutrient Agar

Plate (NAP) dikultur dalam medium Nutrient Broth (NB) selama 24 jam dalam

inkubator 37oC. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus pada medium NB

dilakukan pengukuran spektrofotometri dengan panjang gelombang (λ) 610 nm

sehingga diketahui kepadatan bakterinya (OD = Optical Density) yang setara

dengan kepadatan bakteri 108 bakteri/mL. Kemudian dengan rumus pengenceran

N1 x V1 = N2 x V2, kepadatan bakteri tersebut dicampur dengan TSBglu. Dasar

penghitungannya sebagai berikut:

Apabila diperoleh OD bakteri hasil spektrofotometri = 0,38 (N1)

OD bakteri dengan kepadatan 108 bakteri/mL = 0,1 (N2)

Volume keseluruhan dalam satu tabung = 10 mL (V2)

Rumus : N1 x V1 = N2 x V2

38 x V1 = 0,1 x 10

V1 = 1/0,38 = 2,63 mL

Suspensi bakteri sebanyak 2,63 mL diambil dan ditambah dengan 7,37

mL TSBglu menjadi suspensi bakteri dengan kepadatan 108 bakteri/mL.

4.7.2.3 Uji Deteksi Pembentukan Biofilm (Metode Tabung) (Christensen et

al, 2000)

Staphylococcus aureus yang sudah teridentifikasi ditanam dalam

Nutrient Broth dan diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Bakteri yang sudah
tumbuh pada Nutrient Broth, ditanam kembali pada NAP (sebanyak 40 μL)

kemudian diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Mikroba kultur semalam

dimasukkan ke tabung TSBglu (10mL) dan diinkubasikan 37oC selama 24 jam.

Lalu tabung dicuci dengan PBS (pH 7,3) dan dikeringkan airnya. Tabung yang

sudah dikeringkan diberi kristal violet (0,1%) dan kelebihan warna dibuang dan

tabung dicuci dengan deionized water. Tabung dikeringkan dan dilihat formasi

biofilmnya.

4.7.3 Uji Hambat Pembentukan Biofilm

1. Menyediakan 6 tabung steril untuk mencampurkan larutan ekstrak

TSBglu sebagai medium serta perbenihan bakteri yang digunakan untuk

uji hambat pembentukan biofilm serta 1 tabung propilen untuk

mencampurkan TSBglu dan perbenihan bakteri

2. Melakukan perhitungan jumlah ekstrak, TSBglu, serta perbenihan bakteri

yang akan digunakan pada setiap tabung dengan konsentrasi berbeda.

Setiap tabung akan berisi 5 mL larutan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih. Perhitungan dengan menggunakan rumus N1 x V1 = N2 x

V2.

3. Menyiapkan perbenihan cair bakteri dengan konsentrasi kuman.

4. Perbenihan cair bakteri dengan konsentrasi kuman 1 x 108 CFU/mL dan

TSBglu sejumlah hasil perhitungan dimasukkan ke dalam tabung propilen

dan dihomogenkan sehingga terbentuk perbenihan bakteri dengan

konsentrasi 1 x 107 CFU/mL

5. Perbenihan bakteri konsentrasi 1 x 107 CFU/mL kemudian dimasukkan ke

dalam 6 tabung sesuai dengan hasil perhitungan tiap konsentrasi

6. Mengisi larutan ekstrak ke dalam 6 tabung sebesar hasil perhitungan tiap

konsentrasi. Rincian 6 tabung sebagai berikut:

Tabung 1 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 5%

Tabung 2 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 10%

Tabung 3 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 15%

Tabung 4 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 20%

Tabung 5 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 25%

Tabung 6 : 5 mL larutan dengan konsentrasi akhir ekstrak etanol

bawang putih sebesar 0% (kontrol positif)

7. Seluruh tabung diinkubasikan selama 24 jam dengan suhu 37oC

8. Setelah 24 jam, tabung dikeluarkan dari inkubator dan dicuci dengan PBS

(pH 7,3) dan dikeringkan airnya.

9. Tabung yang sudah dikeringkan diberi kristal violet (0,1%) 0,5 mL lalu

kelebihan warna dibuang dan tabung dicuci dengan deionized water.

10. Tabung dikeringkan. Formasi biofilm yang terbentuk dilihat dan dicatat
4.7.4 Pengukuran Mean Gray Value

Hasil pembentukan biofilm pada tabung difoto dengan menggunakan

kamera digital. Untuk mengetahui intensitas warna pada area cincin dan dinding

tabung masing-masing kelompok digunakan program aplikasi Adobe Photoshop

CS3. Langkah-langkahnya adalah dengan membuka Adobe Photoshop CS3,

pilih File dan masukkan hasil fotonya. Selanjutnya pilih tab Window dan pilih

Measurement Log, blok area yang akan dilihat intensitas warnanya dengan

menggunakan Rectangular Marquee Tool, lalu klik Record Measurements maka

akan didapatkan nilai Mean Gray Value yang merupakan rerata dari intensitas

warna pengecatan tabung.

4.8 Analisis Data

Analisis data yang digunakan adalah Uji One Way ANOVA dan Uji

Korelasi Pearson. Uji One Way ANOVA dengan derajat kepercayaan 95%

(α=0,05) digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan pengaruh antara

berbagai konsentrasi ekstrak etanol bawang putih terhadap intensitas warnya

yang ditimbulkan oleh biofilm pada tabung (Mean Gray Value). Sedangkan Uji

Korelasi Pearson digunakan untuk mengetahui hubungan antara masing-masing

konsentrasi ekstrak etanol bawang putih terhadap intensitas warna biofilm pada

tabung (Mean Gray Value). Analisis data meggunakan Statistical Product of

Service Solution (SPSS) versi 13.0

4.9 Rancangan Operasional Penelitian

Uji Hambat Pembentukan Biofilm

Perhitungan jumlah ekstrak, TSBglu, serta perbenihan bakteri pada 6 tabung

dengan konsentrasi berbeda untuk mendapatkan larutan konsentrasi akhir ekstrak
etanol bawang putih sebanyak 5 mL.

Perbenihan cair bakteri dengan konsentrasi kuman 1 x 108 CFU/mL dicampur

TSBglu sehingga terbentuk perbenihan bakteri dengan konsentrasi 1 x 107 CFU/mL

Mengisi larutan ekstrak ke dalam 6 tabung sebesar hasil perhitungan tiap

konsentrasi sehingga terbentuk konsentrasi akhir 5%, 10%, 15%, 20%, dan 25%

Inkubasi selama 24 jam dalam suhu 37oC

Cuci dengan PBS (pH 7,3) lalu tiriskan

Cat dengan Kristal Violet (0,1%) 5 mL

Diamkan selama 20 menit

Buang sisa Kristal Violet dan cuci dengan Deionized water, lalu tiriskan

Amati formasi cincin dan dinding ungu kebiruan

Ukur Mean Gray Value menggunakan Adobe Photoshop CS3

Analisis Data