Cara Kerja

a. Sterilisasi Alat
1) Cawan petri, tabung reaksi, pipet ukur, corong kaca, spreader, batang
pengaduk yang akan digunakan dicuci bersih dan dikeringkan
2) Kemudian dibungkus dengan kertas kopi
3) Disterilkan dalam oven pada suhu 180 oC selama 2 jam
b. Pembuatan Media MHA
1) Timbang 3,8 gram bubuk Media Mueller Hinton
2) Larutkan dengan aquadest sebanyak 100 ml.
3) Panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media.
4) Sterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
5) Tunggu suhu sampai hangat-hangat kuku (45°C-50°C).
6) Homogenkan
7) Tuang ke dalam cawan petri steril dan simpan pada suhu 2-8 oC
c. Pembuatan Standar Mc. Farland 0,5
1) Disediakan satu tabung bersih dan steril
2) Kedalam tabung dimasukkan larutan sebanyak 9,95 ml H2SO4 1%
kemudain ditambahkan dengan 0,05 ml BaCl2 1%
3) Dihomogenkan
4) Kekeruhan yang terjadi setara dengan kerapatan bakteri 1,5 x 108
CFU/ml
d. Pembuatan Supensi E.coli
1) Disiapkan strain murni E.coli
2) Disediakan tabung reaksi bersih dan steril yang berisi 10 ml NaCl
fisiologis steril
3) Secara steril ambil koloni E.coli dengan menggunakan ose bulat, lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl fisiologis dan
dicampurkan hingga homogen
4) Dibandingkan sampai kekeruhannya setara dengan standar Mc. Farland
0,5
e. Pembuatan Konsentrasi Air Perasan Daun Trembesi
 1) Diambil daun trembesi yang segar dan dicuci dengan air mengalir dan
aquades, kemudian ditiriskan.
2) Dimasukkan daun trembesi tersebut kedalam juicer yang sebelumnya
sudah dibilas dengan alkohol 70%.
3) Kemudian diperas dengan menggunakan kasa steril dan kapas steril
diatas corong kaca.
4) Sehingga diperoleh air perasan daun trembesi murni 100 %.
5) Dipanaskan air perasan tersebut pada suhu 56 oC selama 30 menit dalam
waterbath
6) Kemudian diencerkan dengan aquadest steril menjadi konsentrasi 80%,
60%, 40%, 20% dan 10%.
7) Pengenceran dapat dilihat dalam tabel 3

Tabel 1. Pengenceran air perasan daun trembesi

Pengencer
Volume Volume
No Konsentrasi / Konsentrasi
awal yang akhir
Tabung awal (%) aquadest akhir (%)
dipipet (mL) (mL)
(mL)
1. 100 5,0 - 5,0 100
2. 100 4,0 1,0 5,0 80
3. 100 3,0 2,0 5,0 60
4. 100 2,0 3,0 5,0 40
5. 100 1,0 4,0 5,0 20
6. 100 0,5 4,5 5,0 10

f. Pembuatan Paper Disc Berisi Masing-masing Konsentrasi untuk Prosedur

Penentuan Kemampuan Daya Hambat
Paper disc blank berdiameter 6 mm disiapkan dan diletakkan di atas
cawan petri steril kemudian direndam ke masing-masing konsentrasi air
perasan daun trembesi sebanyak 5mL lalu diamkan 30 menit hingga kering.
g. Pelaksanaan Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan air perasan daun trembesi dalam menghambat bakteri
Escherichia coli dilakukan dengan cara difusi cakram dengan menggunakan
metode Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) pada media Mueller Hinton,
dengan cara sebagai berikut :
1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2) Suspensi Escherichia coli disebar secara merata pada permukaan media
agar Mueller Hinton yang sudah padat
3) Kertas cakram dengan konsentrasi 80%, 60%, dan 40% diletakkan diatas
media Mueller Hinton Agar
4) Setelah 24 jam, diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni dan zona
hambat pada media Mueller Hinton Agar, lalu diukur menggunakan
penggaris
5) Uji kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol
6) Untuk kontrol negatif digunakan kontrol paper disc blank, digunakan
juga kontrol air perasan daun trembesi dan kontrol media
h. Pelaksanaan Uji Penelitian
Uji penelitian air perasan daun trembesi dalam menghambat
pertumbuhan Escherichia coli dilakukan dengan cara difusi cakram dengan
media MHA, dengan cara sebagai berikut:
1) Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2) Suspensi bakteri Escherichia coli disebar secara merata pada
permukaan medium agar Mueller Hinton yang sudah padat
3) Kertas cakram dengan konsentrasi 80%, 60%, 40%, 20% dan 10%
diletakkan di atas media Mueller Hinton Agar
4) Kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada suhu
37oC.
5) Setelah 24 jam, diamati ada tidaknya pertumbuhan koloni dan zona
hambat pada media Mueller Hinton, lalu diukur menggunakan
penggaris
 6) Untuk kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol
Untuk kontrol negatif digunakan kontrol paper discblank, digunakan juga kontrol air perasan
daun trembesi dan kontrol media