BAB III

METODE PENELITIAN

A. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni

dengan desain post eksperimental. Dengan melihat kadar bunuh minimum

ekstrak daun jati belanda dengan konsentrasi 12,5% b/v, 25% b/v, 50%

b/v.

B. Lokasi dan Waktu Penelitian

1. Lokasi penelitian

a. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi Universitas Ngudi

Waluyo Ungaran.

b. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Ekologi dan

Biosistematik Fakultas Sains dan Matematika Jurusan Biologi

Universitas Diponegoro Semarang.

2. Waktu penelitian

Waktu penelitian dilakukan pada bulan November - Desember 2016

C. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) dengan

konsentrasi 12,5% b/v, 25% b/v, dan 50% b/v.

 2. Variabel tergantung

Zona bunuh pada biakan bakteri Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli.

3. Variabel terkendali

Media biakan bakteri, suhu inkubasi yaitu 37oC dan waktu inkubasi

selama 24 jam.

D. Prosedur Penelitian

1. Alat dan Bahan

a. Alat

Seperangkat alat maserasi, blender, neraca, batang pengaduk,

kertas saring, erlemeyer, gelas ukur, penangas air, selang, cawan

petri, mikro pipet, tabung reaksi, oven, autoclave, inkubator.

b. Bahan

Daun jati belanda, etanol, H2SO4, FeCl3 1%.

2. Prosedur penelitian

a. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Ekologi

dan Biosistematik Fakultas Sains dan Matematika Jurusan Biologi

Universitas Diponegoro Semarang.

b. Penyiapan bahan

Daun jati belanda yang masih segar dicuci dengan air yang

mengalir dan dilakukan sortasi basah, kemudian dilakukan

perajangan pada daun jati belanda dan dikeringkan di bawah sinar

 matahari tidak langsung dengan ditutupi dengan kain hitam.

Setelah kering, dilakukan sortasi kering, kemudian daun jati

belanda dibuat serbuk dengan cara diblender sampai halus dan

diayak dengan ayakan No.30

c. Pembuatan Ekstrak Daun jati belanda

Pembuatan ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia

Lamk.) yaitu menggunakan metode maserasi. Sebanyak 500 g

serbuk halus dimasukkan ke dalam bejana kemudian dituangi 3750

ml etanol, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari

cahaya, sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari kemudian

disaring dan didapatkan maserat pertama. Ampas yang didapatkan

ditambahkan 1250 ml etanol, dibiarkan di dalam bejana yang

tertutup dan terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian

endapan dipisahkan dan didapat hasil maserat ke-2. Setelah itu

hasil maserat pertama dan ke-2 dicampurkan kemudian diuapkan di

atas waterbath hingga didapat ekstrak kental daun jati belanda.

 500 g daun jati belanda kering

Direndam dengan etanol sebanyak 3750 ml selama 5 hari dan diaduk sesekali

Disaring

Maserat 1 Ampas

Remaserasi dengan etanol

sebanyak 1250 ml selama 2 hari

Disaring

Maserat 2 Ampas

Dicampur maserat 1 dan 2

Diuapkan dengan waterbath pada suhu 60oC

Ekstrak kental

Gambar 3.1 Pembuatan ekstrak daun jati belanda

d. Pengujian Zat Bioaktif

1) Identifikasi senyawa Flavonoid

 a) Diambil 0,1 g sampel ditambahkan metanol sampai

terendam lalu dipanaskan hasil filtratnya ditambahkan

H2SO4. Reaksi positif ditandai dengan adanya perubahan

warna dari kuning kehijauan menjadi warna merah.

b) Diambil tiga tetes sampel dalam tabung reaksi ditambahkan

1 tetes FeCl3 1% kemudian warna dicatat, hasil positif dari

penambahan pereaksi ini menghasilkan warna hijau, merah,

ungu, hitam, dan biru.

2) Identifikasi senyawa tanin

Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas, didihkan,

selama 5 menit dan disaring. Sebagian filtrat yang diperoleh

ditambah larutan FeCl3 1%. Hasil positif ditunjukkan oleh

terbentuknya warna hijau kehitaman.

e. Uji antibakteri

1) Perlakuan uji aktivitas antibakteri

Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri

ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) terhadap

bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yaitu :

a) Kontrol positif = Media + suspensi bakteri + ciprofloxacin

b) Kontrol negatif = Media + suspensi bakteri + aquades

c) Kontrol pertumbuhan = Media + suspensi bakteri

d) Kontrol media = Media

e) Perlakuan = Media + suspensi bakteri + ekstrak daun jati

belanda dengan konsentrasi 12,5% b/v, 25% b/v, 50% b/v

2) Sterilisasi alat dan bahan

Sebelum penelitian perlu dilakukan sterilisasi alat dan

bahan. Alatalat seperti tabung reaksi, cawan petri, batang

pengaduk, gelas ukur, dan erlemeyer dicuci bersih kemudian

dikeringkan hingga tidak terdapat titik air agar tidak timbul

noda yang sulit hilang setelah disterilkan. Setelah alat-alat

tersebut kering kemudian dibungkus dengan kertas dan

disterilkan dengan oven pada suhu 2000C selama 30 menit.

Bahan-bahan yang digunakan seperti media dan aqudest

disetrilkan dengan pemanasan basah menggunakan autoklaf

pada suhu 1210C selama 15 menit (Unus, 1986).

3) Pembuatan larutan ciprofloxacin

Pembuatan larutan ciprofloxacin sebagai kontrol positif dibuat

dari sediaan obat tablet Ciprofloxacin 500 mg. Satu tablet

Ciprofloxacin digerus, lalu ditimbang dan disetarakan dengan

500 mg. Kemudian serbuk Ciprofloxacin dilarutkan dalam

aquades untuk memperoleh larutan Ciprofloxacin 50

g/50 l.

4) Pembuatan stok ekstrak daun jati belanda

Pembuatan stok ekstrak etanol daun jati belanda

(Guazuma Ulmifolia Lamk.) 100% b/v (100 g/ 100 ml) yaitu

dengan cara 100 g ekstrak etanol daun jati belanda (Guazuma

Ulmifolia Lamk.) dilarutkan dengan aquades sampai 100 ml.

 Kadar 100% b/v tersebut kemudian dibuat menjadi 3 seri

konsentrasi yaitu 12,5% (b/v), 25% (b/v), dan 50% (b/v).

5) Pembuatan seri konsentrasi

a) Konsentrasi 50% (b/v)

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 100% = 50 ml x 50%

V1 = 25 ml

Untuk mendapatkan konsentrasi 50% maka dibutuhkan 25

ml larutan konsentrasi 100% ditambahkan aquades add 50

ml.

b) Konsentrasi 25% (b/v)

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 50% = 50 ml x 25%

V1 = 12,5 ml

Untuk mendapatkan konsentrasi 25% maka dibutuhkan

12,5 ml larutan konsentrasi 50% ditambahkan aquades add

50 ml.

c) Konsentrasi 12,5% (b/v)

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 25% = 50 ml x 12,5%

V1 = 6,25 ml

Untuk mendapatkan konsentrasi 12,5% maka dibutuhkan

6,5 ml larutan konsentrasi 50% ditambahkan aquades add

50 ml.
6) Uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi

Uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi

dilakukan dengan cara Kirby bauer, dengan cara suspensi

bakteri diuji sensitivitas dengan meratakan suspensi bakteri

tersebut pada permukaan media agar. Kertas cakram yang telah

diberi ekstrak jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.)

dengan seri konsentrasi 12,5% (b/v), 25% (b/v), dan 50% (b/v)

diletakkan di atas media tersebut dan kemudian diinkubasi pada

suhu 370 C selama 24 jam. Setelah itu diamati dan diukur zona

hambat yang terbentuk sehingga diperoleh KHM dan

selanjutnya dilakukan pengukuran KBM dengan cara

menggoreskan beningan yang dihasilkan dari pengujian KHM

kedalam media baru, diinkubasi pada suhu 370 C selama 24

jam dan diamati.

 Kertas cakram kosong direndam Kertas cakram kosong
semalam dalam ekstrak Ekstrak daun dimasukkan dalam larutan
jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.)
kotrol
L.)

12,5% (b/v) 25% (b/v) 50% (b/v) K (+) K (-)

ciprofloksasi aquades
n

Kertas cakram diangkat dan ditiriskan

Kertas cakram diletakkan diatas cawan petri yang

berisi media agar MHA yang telah diinokulasi
bakteri uji

Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam

Diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk

KBM

Gambar 3.2 Prosedur Penelitian

E. Pengolahan Data

Data diperoleh dari uji antibakteri. Uji antibakteri didapatkan data

diameter zona hambat bakteri pada masing-masing konsentrasi dan kadar

bunuh minimum yang disajikan dalam bentuk tabel.

F. Analisa Data

Analisa data penelitian ini adalah analisis deskriptif dengan cara

mengamati ada tidaknya zona hambat yang terbentuk pada masing-masing

konsentrasi dan kontrol. Dikatakan positif apabila terdapat daerah zona

hambat yang ditandai dengan adanya zona bening pada media dan

dikatakan negatif apabila tidak terbentuk daerah zona hambat pada media

setelah dilakukan metode difusi. Daerah zona hambat yang terbentuk

diukur diameter beningan menggunakan jangka sorong. Dan kemudian

dilakukan pengukuran kadar bunuh minimum dengan cara menggoreskan

beningan yang dihasilkan dari pengujian KHM kedalam media baru.

Dikatakan dapat membunuh bakteri bila tidak ada pertumbuhan bakteri

pada media yang telah di goresi dengan beningan.