3.7.

Prosedur Penelitian
3.7.1 Ekstraksi Daun Leilem
Daun leilem dibersihkan dengan dicuci dibawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan dan
dikering-anginkan pada suhu ruangan. Daun yang sudah kering kemudian dihaluskan. Serbuk
daun leilem ditimbang seberat 93 gram, lalu dimasukan dalam wadah dan ditambahkan etanol
70% sampai terendam lalu diaduk hingga homogen, tutup segera kemudian disimpan dalam
ruangan yang terhindar dari cahaya matahari selama 3 x 24 jam. Pada saat perendaman, diaduk
setiap hari selama 15 menit. Setelah direndam selama 3 x 24 jam, disaring menggunakan kertas
saring lalu dilakukan pemisahan zat pelarut dan filtratnya menggunakan set destilasi. Hasil dari
pemisahan tersebut adalah ekstrak pekat. Ekstrak inilah yang akan digunakan dalam penelitian
(Bontjura dkk., 2015).

3.7.2 Uji Fitokimia Secara Kualitatif

3.7.2.1 Uji Saponin
Ekstrak dicampur dengan 5 mL aquades kemudian dikocok kuat-kuat selama 30 detik
kemudian diamkan selama 15 menit. Positif mengandung saponin jika terbentuk busa selama
tidak kurang dari 10 menit busa tidak hilang (Utami dkk., 2017).
3.7.2.2 Uji Alkaloid
Ekstrak dicampur dengan 5 mL kloroform dan 5 mL amoniak kemudian dipanaskan,
dikocok dan disaring. Asam sulfat 2 N sebanyak 5 tetes ditambahkan pada masing-masing filtrat,
kemudian kocok dan diamkan. Bagian atas dari masing-masing filtrat diambil dan diuji dengan
pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorff. Terbentuknya endapan putih, cokelat dan jingga
menunjukkan adanya alkaloid (Utami dkk., 2017).
3.7.2.3 Uji Flavonoid
Ekstrak dicampur dengan 3 mL etanol 70% lalu dikocok, dipanaskan dan dikocok lagi
kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan serbuk Mg 0,1 g dan 2 tetes HCl pekat.
Terbentuknya warna merah pada lapisan etanol menunjukan adanya flavonoid (Utami dkk.,
2017).
3.7.2.4. Uji Tanin
Ekstrak sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan 10 mL akuades. FeCl dilarutkan dengan 10
mL Aquades. Ekstrak dipanaskan pada tabung reaksi kurang lebih 5 menit. Lalu masukkan 10
tetes pada salah satu tabung (Utami dkk., 2017).
3.7.3. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan dicuci terlebih dahulu kemudian disterilkan, untuk alat-alat gelas
ditutup dengan kapas steril dan dibungkus menggunakan kertas. Untuk petridish di bungkus
menggunakan kertas kemudian dimasukkan ke dalam autoclave pada suhu 121oC, tekanan 1 atm
selama 15 menit.

3.7.4 Persiapan media uji.

Pembuatan media MHA (Mueller Hinton Agar)
Bahan yang digunakan untuk membuat media MHA yaitu bubuk media MHA, dan
aquadest. Dibuat dengan menimbang 5,7 gram media, kemudian ditambahkan 150 ml aquades.
Panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media. Setelah itu disterilkan kembali dengan
autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit. Media yang telah steril akan didinginkan hingga
mencapai 45oC - 50oC. Lalu disimpan pada suhu 2-8oC.
Pembuatan media NB (Nutrient Broth)
Bahan yang digunakan untuk membuat media NB yaitu dengan melarutkan NB dan
aquadest. Dibuat dengan menimbang 0,16 gram media, kemudian ditambahkan 20 ml aquadest.
Panaskan hingga mendidih untuk melarutkan media. Selanjutnya, disterilkan dengan autoclave
pada suhu 121oC selama 15 menit bersamaan dengan pembuatan MHA.
3.7.5 Persiapan Bakteri Uji
Dilakukan uji identifikasi bakteri E.coli bakteri gram negatif strain bakteri patogen yang
didapat dari koleksi Laboratorium Farmasi Universitas Prisma. Diremajakan dengan
menggunakan media NB kemudian diinkubasi 37oC selama 24 jam.

3.7.6 Uji Aktivitas Antibakteri

 Metode pengujian digunakan adalah metode modifikasi Kirby-Bauer dengan menggunakan
paper disk. Bakteri E. coli yang disimpan di media agar yang diambil dari stok bakteri murni dari
Laboratorium Farmasi Universitas Prisma Manado, diambil dengan jarum ose, lalu diremajakan
pada media cair NB satu hari sebelum pengujian. Bakteri yang telah diinkubasi diambil
koloninya dari NB dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam H 2O steril
sampai kekeruhannya sama dengan standar Mc Farland 0,5. Lidi kapas steril dicelupkan
kedalam suspensi bakteri hingga basah. Lidi Kapas diperas dengan ditekan pada dinding tabung
reaksi bagian dalam, kemudian digores merata pada media MHA sampai permukaannya
tertutupi. Selanjutnya diletakkan cakram yang dibuat dari kertas saring kemudian dicelupkan
sesuai dengan perlakuan yang ada. Selanjutnya cawan petri diinkubasi dalam inkubator dengan
suhu 37oC selamat 24 jam. Zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disk diukur diameter
vertikal dan diameter horizontal dalam satuan millimeter (mm) menggunakan jangka sorong.

3.7.6 Indikator yang diamati

Pengamatan zona bening yang terbentuk kemudian diukur dengan menggunakan jangka
sorong dalam satuan milimeter (mm).

3.7.7 Analisis data

Data dianalisis menggunakan One Way Anova melalui aplikasi SPSS. Sebelumnya
dilakukan uji prasyarat normalitas dan homogenitas jika data tidak berdistribusi normal maka
dilanjutkan dengan uji Kruskall-Walis
3.8. Diagram Alur Penelitian

Gambar 3. 2 Diagram alur penelitian

 Daun leilem

Pembuatan simplisia

- pengambilan sampel
-Pengeringan
-Penghalusan (Blender)
-Ayak

Pembuatan ekstrak

- Menggunakan alkohol 70%

- Penyaringan
- Penguapan dengan set
destilasi

Ekstak etanol daun Leilem

Analisis Fitokimia Uji Antibakteri

- Alkaloid - Sterilisasi alat

- Flavonoid - Persiapan Media uji
- Tanin - Persiapan bakteri uji
- Saponin - Uji antibakteri
menggunakan metode

Pengumpulan data

Analisis data