LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN

STERILISASI EKSPLAN, PENANAMAN, DAN SUBKULTUR

guna memenuhi tugas praktikum Mata Kuliah Kultur Jaringan

Dosen Pengampu :
Dr. Noor Aini Habibah, M.Si.
Prof. Dr. Ari Yuniastuti, M.Kes.

Isnaeni Nur Khasanah / 4411417062

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN UILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2020
 STERILISASI EKSPLAN, PENANAMAN, DAN SUBKULTUR

A. TUJUAN
Kegiatan ini bertujuan untuk melatih ketrampilan mahasiswa dalam proses
sterilisasi dan penanaman eksplan.
B. ALAT DAN BAHAN
Alat :
1. Scalpel
2. Cawan petri
3. Bunsen
4. Pinset
5. LAF
6. Botol steril
7. Penutup pbotol
8. Sprayer alkohol
9. Entkas

Bahan :
1. Eksplan
2. Medium kultur
3. Clorox 20%
4. Fungisida
5. Bakterisida
6. Twen-20
7. Aquades steril
8. Alkohol 96%

C. DASAR TEORI
Dari semua sumber kontaminasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan
merupakan yang paling sulit diatasi. Untuk itu diperlukan bahan sterilan yang tepat
untuk menghilangkan kontaminan dari eksplan. Kontaminan hidup dapat berupa
cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora. Bila kontaminan ini
tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral,
dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang akhirnya
mengakibatkan eksplan menjadi mati. Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi
adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari
bagian permukaan eksplan atau disebut desinfestasi (Muslim, 2010).
Sterilisasi eksplan terdiri dari dua metode atau dua cara yaitu secara mekanis
dan secara kimiawi.
a. Sterilisasi eksplan secara mekanis
Sterilisasi eksplan secara mekanis dugunakan untuk eksplan yang keras atau
berdaging yaitu dengan membakar eksplan di atas lampu spirtus sebanyak tiga
kali. Eksplan keras yang disterilisasi dengan cara ini yaitu tebu, biji salak, bung,
buah anggrak dan kapulaga. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain wortel,
umbi, bawang putih.
b. Sterilisasi eksplan secara kimiawi
 Sterilisasi eksplan secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak
(jaringan muda) seperti daun, tangkai daun dan anther. Bahan-bahan kimia yang
dapat digunakan untuk sterilisasi antara lain:
1. Sodium hipoklorit
Nama dagangnya adalah Clorox dan bayclin. Konsentrasi untuk steril
tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5% - 10% dan waktunya antara 5
– 10 menit. Pembuatan larutan Clorox adalah dengan menuangkan Clorox
dan aquades dengan perbandingan 1 : 4 (misalkan 25 ml Clorox dan 100
ml aquades), lalu ditambahkan dengan tween-20 sebanyak satu tetes dan
dicampur.
Cara sterilisasi di dalam laminar air flow adalah sebagai berikut:
pertama-tama adalah eksplan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang
berisi larutan Clorox, kemudian leher Erlenmeyer dipegang dan digoyang-
goyangkan dengan arah memutar mendatar selama kurang lebih 3 menit,
langkah selanjutnya adalah mencuci bersih eksplan tersebut dengan
aquades steril sebanyak 3 – 5 kali, masing-masing selama 3 menit. Setelah
selesai eksplan diambil dengan pinset dan diletakkan di atas petridish yang
ada kertas saringnya. Dengan demikian eksplan sudah siap untuk
disimpan.
2. Merkuri klorit
Nama dagandnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini
harus berhati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan
menggunakan sublimat sama dengan sterilisasi dengan menggunakan
Clorox, hanya waktunya lebih pendek karena bersifat keras. Bila sterilisasi
terlalu lama dapat menyebabkan kerusakan pada eksplan (berwarna coklat)
sehingga eksplan tersebut tidak akan mampu tumbuh menjadi kalus.
3. Alkohol 70%
Alcohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alcohol 95%.
Jamur biasanya mati dengan alcohol 70%, sedangkan dalam alcohol 95%
masih tetap hidup. Oleh karena itu, alcohol 95% perlu di encerkan menjadi
70%. Caranya adalah sebagai berikut: tuangkan alcohol 95% sebanyak 25
ml ke dalam gelas ukur, kemudian tambahkan aquades sebanyak 70 ml
sehingga volume akhir menjadi 95 ml.

D. HASIL PRAKTIKUM
Pada tahap sterilisasi eksplan langkah-langkahnya adalah eksplan biji dicuci di
air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya disterilisasi dengan detergen cair 1 tetes
dengan dishaker selama 15 menit. Kemudian dibilas dengan aquadest steril 3x. Lalu
direndam dan dishake dengan larutan bakterisida dan fungisida selama sejam.
Bakterisida dan fungisida dicampurkan, dengan takaran 1 : 1 dan diberi aquadest steril
¾ botol. Lalu dibilas dengan aquadest steril 3x. Lalu menyiapkan larutan clorox 20%.
Untuk sterilisasi dengan clorox 20% dilakukan didalam LAF. Selama dalam proses
shaker, botol ditutup jika ingin dikeluarkan maka harus berada didekat api bunsen.
Pada tahap penanaman, eksplan dipotong kecil-kecil untuk ditanam. Setiap
akan membuka wadah media penanaman harus dalam keadaan steril dan bagian tutup
botol disetrilkan di sekitar api bunsen. Hindari pembukaan terlalu lama. Ambil
 eksplan dan taruh petridish, lalu tutup. Pinset dan scalpel dicelupakn di alkohol 96%,
biar steril.
E. PEMBAHASAN
Penanaman eksplan wortel (Daucus carota) dan bawang putih (Allium
sativum) dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow). Berdasarkan namanya, laminar
ini mengandung pergerakan udara yang steril. Sehingga memungkinkan bekerja
melakukan penanaman dalam kondisi yang steril. Dalam melakukan penanaman,
beberapa hal yang perlu diperhatikan diantaranya adalah (Anonimous, 2009):
1. Semprot atau usap baigan dalam laminar flow cabinet dengan 70% etil
atau isopropyl alcohol sebelum menghidupkan cabinet. Alcohol 70%
penting dinguankan, absolute alcohol (95%) tidak membunuh mikroba).
2. Hidupkan cabinet. Jika anda menggunakan lampu UV pastikan anda sudah
mematikannya sebelum meletakkan bahan tanaman di dalam cabinet.
3. Semprot semua wadah dan bahan dengan ethanol 70% sebelum
meletakkannya dalam cabinet.
4. Cuci tangan dan lengan dengan sabun dan air dan usap dengan 70%
ethanol sebelum mengambil tanaman. Penting dicatat bahwa ethanol
memiliki efek residual; karenanya sebaiknya menggunakan Hexifoam
(desinfektan untuk kulit).
5. Jika menggunakan api, berhati-hatilah
6. Atur ruang kerja dalam cabinet sehingga tidak banyak gerakan tangan
menyilang di dalam cabinet.
7. Jika bahan tanaman jatuh ke permukaan cabinet, anggap terkontaminasi
dan buang
8. Setelah selesai mentransfer kultur, matikan cabinet, semprot atau usap
dengan 70% ethanol dan tutup cabinet.
Eksplan atau dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti
jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme–organisme tersebut secara universal
terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka
tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering
dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol.
Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara
dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai
mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, mengalahkan
eksplan.
Meskipun usaha sterilisasi untuk menciptakan lingkungan yang aseptic sudah
sering dilakukan, namun kontaminasi masih sering terjadi. Kontaminasi yang terjadi
diperkirakan disebabkan oleh mikrobia golongan protista. Sebagai sumber utama
kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada proses sterilisasinya.
Diantaranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen ditujukan untuk
menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di rendam dalah
alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya dicelupkan pada
larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di bagian dalam eksplan.
Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun cendawan yang
diperkirakan ada pada eksplan.

F. KESIMPULAN
a. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat
sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara
mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam alcohol 96% lalu dibakar pada nyala api
 Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap botol
kultur, diisi 3 potong eksplan.
b. Langkah kerja yang harus dilakukan harus bersifat aseptik. Agar terhindar dari
kontaminasi bakteri dan jamur.

G. DAFTAR PUSTAKA
Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 2011. Plant tissue culture general
principles and commercial applications. Queensland Department of Primary
Industries. Brisbane. 31 p.
George, E.F. & P.D. Sherrington. 2010. Plant propagation by tissue culture.
Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd.,
Basingstoke, England. 546 p.
Gunawan, L.W., 2011. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur
Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian
Bogor. Bogor. 304 h.
H. DOKUMENTASI

Proses penanaman Alat-alat yang digunakan dalam penaman