A.

Inokulasi Eksplan
Inokulasi bahan eksplan adalah kegiatan penanaman bahan tanam (eksplan) ke
dalam media inisiasi baik berupa media padat/cair dalam botol kultur di laminar air flow
cabinet/enkas dengan kondisi aseptik. Kondisi aseptik diperlukan untuk keberhasilan
inokulasi eksplan sehingga kegiatan inokulasi memerlukan peralatan dan bahan yang
mendukung terciptanya kondisi yang aseptik.
Laminar atau enkas merupakan meja kerja steril tempat inokulasi eksplan maka
untuk menciptakan kondisi aseptik laminar atau enkas perlu disterilisasi terlebih dahulu
dengan cara menyalan lampu Ultra Violet (UV) minimal 30 menit sebelum dioperasikan.
Apabila pada enkas tidak terdapat lampu UV, Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara
menempatkan larutan formalin 5% pada petridish/cawan petri yang diletakkan didalam
enkas selama 1 malam.
Penanaman eksplan tebu yang akan digunakan itu diambil dari bagian pucuk dari
tanaman tebu yang di potong potong bagian lipatan daun yang ada di pucuk yang terlebih
dahulu di celup bakar dengan alkohol dan dibakar dengan pembakar bunsen. Untuk
mendapatka ekplan tebu yang baik dan bagus itu pelaksanaannya pun harus baik dan
steril, dilaksanakan secara teratur dan teliti.
Penanaman secara in vitro itu harus steril, mulai dari peralatan, ruangan sampai
bahan yang akan digunakan pun harus steril. Dalam pelaksanaan ini digunakan alkohol
70% dan di masukkan pada dua tempat yang berbeda, tujuannya itu untuk mensterilkan
bahan dan alat yang digunakan.
Eksplan tebu dicelup pada alkohol 70 % dan dibakar pada bunsen sampai berkali-
kali, sampai didapatkan bagian terdalam dari eksplan tebu ini. Bagian yang akan
digunakan pada saat penanaman yaitu bagian terdalam yang warnanya berwarna putih
dan inilah nantinya yang akan digunakan pada saat penanaman pada media yang telah di
buat sebelumnya dengan berbagai konsentrasi zatpengatur tumbuh yaitu berupa auksin
dan sitokinin.Dalam melakukan peanaman eksplan ini harus hati-hati karena mudah
terkontaminasi makanya apabila akan menancapkan eksplan kedalam media mulit botol
harus tetap dekat dengan api agar tidak terkontaminasi dengan patogen. Dengan
melakunakan penanaman eksplan di dalam laminar air flow maka semua alat dan bahan
yang di gunakan akan streil dan terhindar dari kontaminasi cendawan dan bakteri.
B. Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan
mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi berkembang biak atau
 menjadi sumber kontaminan selama proses perkembangan berlangsung. Proses sterilisasi
yang tidak sempurna akan menimbulkan adanya kontaminasi. Kontaminasi yang umum
terjadi adalah kontaminasi oleh cendawan dan bakteri. Komposisi medium kultur
jaringan yang mengandung gula, vitamin, asam asam amino, garam-garam anorganik,
air, zat pengatur tumbuh, dan bahan pemadat sangat menguntungkan untuk pertumbuhan
cendawan dan bakteri. Bila diberi kesempatan maka organisme tersebut akan tumbuh
dengan cepat, dan dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium dan eksplan
yang ditanam. Selanjutnya organisme ini menyerang eksplan melalui bekas luka
pemotongan pada saat perlakuan sterilisasi. Beberapa jenis mikroorganisme melepaskan
senyawa beracun ke dalam medium kultur yang dapat menyebabkan kematian eksplan.
Beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur jaringan, adalah: (1)
media, (2) lingkungan kerja yang kurang steril dan pelaksanaan penanaman yang kurang
hati-hati dan kurang teliti, (3) eksplan, secara internal (kontaminan terbawa di dalam
jaringan tanaman), (4) eksplan, secara eksternal (kontaminan berada di permukaan
eksplan akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna, (5) serangga atau hewan kecil
yang masuk ke botol kultur setelah diletakkan pada ruang kultur. Dari semua sumber
kontaminasi, yang paling sulit diatasi ialah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu,
dalam memilih suatu metode sterilisasi dan bahan sterilisasi haruslah selektif, dengan
prinsip semaksimal mungkin menghilangkan mikroorganisme kontaminan yang tidak
diinginkan dengan gangguan sekecil mungkin pada jaringan eksplan.
Sterilisasi eksplan dapat dilaksanakan dengan dua cara, yaitu secara mekanik dan
secara kimia. Sterilisasi eksplan secara mekanik digunakan untuk eksplan yang keras
(misalnya tebu, biji salak, dan sebagainya) atau berdaging (misalnya wortel, umbi, dan
sebagainya), yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spiritus sebanyak
tiga kali. Sedangkan sterilisasi eksplan secara kimia digunakan untuk eksplan yang lunak
(jaringan muda)seperti daun, tangkai daun, anther, dan sebagainya. Bahan-bahan kimia
yang sering digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan antara lain:
1. Natrium hipoklorit
Nama dagangnya adalah clorox dan bayclin. Konsentrasi untuk sterilisasi
tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5%-20% dan waktunya antara 5-10 menit.
2. Mercuri klorit
Nama dagangnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus hati-
hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasinya sama dengan clorox, hanya
waktunya lebih pendek karena sublimat bersifat keras.
3. Alkohol 70%
Alkohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alkohol 95%. Jamur biasanya
mati dengan alkohol 70%, sedangkan dengan alkohol 95% masih tetap hidup.
Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai
mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan
perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan
percobaan sterilisasi. Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan
untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut :
1. Sterilisasi Ringan
Eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas
dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15%
selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan
pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.
2. Sterilisasi Sedang
Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 7 menit, lalu bilas dengan air
steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10
menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih
pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.
3. Sterilisasi Keras
Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air
steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas
dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20%
selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali.
Menurut Gunawan (1987) ada sekitar sepuluh jenis bahan yang digunakan dalam
sterilisasi permukaan, yaitu kalsium hipoklorit, natrium hipoklorit, hidrogen
peroksida, gas klorin, perak nitrat, merkuri klorid, betadin, fungisida, antibiotik, dan
alkohol.
Tahapan sterilisasi pada eksplan :
1) Ambil meristem apical tebu 20 - 30 cm, helaian daun dipotong dekat sarung daun.
2) Material dimasukkan ke dalam spiritus/alkohol 96% lalu dibakar. Kemudian 1 - 2
helai seludang daun dibuang.
3) Bagian ujung material tebu di bakar lagi, diikuti penglepasan seludang terluar.
Perlakuan ini diulang sampai beberapa kali.
 4) Setelah batang beserta seludangnya yang putih terlihat, bahan siap untuk dijadikan
eksplan.
5) Eksplan dipotong-potong melintang setebal 2 - 4 mm, kemudian ditanam pada media
kultur.
6) Namun prosedur ini tidak mampu menekan tingkat kontaminasi.
7) Tunas muda batang tebu dengan diameter 0,8-1 cm dipotong-potong sepanjang 5-10
cm,lalu direndam dalam air sabun selama 15 menit dan dibilas dengan air mengalir
sampai bersih.kemudian disterilisasi dengan cara sebagai berikut:
a. Dicelup dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkoholnya
habis.
b. Direndam dalam larutan agrimisin 0,2% selama 1,5 jam, lalu direndam dalam
larutan Dithane M-45 0,2% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah
2 tetes Tween 80. Lalu dibilas akuades steril sebanyak 3-4 kali.
c. Sama dengan b, tetapi setelah itu dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu
menit dan dibakar sampai alkoholnya habis.
d. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama 1,5 jam, lalu dalam larutan
Dithane M-45 0,5% selama 1,5 jam, yang masing-masing telah ditambah 2 tetes
Tween 80, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali.
e. Direndam dalam larutan agrimisin 0,5% selama satu jam, lalu dalam larutan
Dithane M-45 0,5% selama satu jam, yang masing-masing telah ditambahi 2 tetes
Tween 80, lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak 3-4 kali. Setelah itu
dicelup ke dalam alkohol 96% selama satu menit dan dibakar sampai alkohol
habis.
Sterilisasi dilakukan dalam kotak transfer yang telah disterilisasi dengan sinar UV
selama 2 jam. Eksplan yang ujungnya mengalami klorosis akibat pengaruh larutan
pensteril dipotong dan dibuang karena diperkirakan jaringan eksplan tersebut telah mati.
Eksplan yang masih segar dipotong-potong sepanjang 0,5-1 cm dengan pisau diseksi
steril.

Referensi
Abbas, B. (2011). Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Alfabeta.
Anis, S., & Oetami, D. (2010). Pengaruh Sterilan Dan Waktu Perendaman Pada Eksplan
Daun Kencur (Kaemferia galanga L) Untuk Meningkatkan Keberhasilan Kultur
Kalus. AGRITECH, XII(1), 11-29.
Hendaryono DPS, Wijayani A. 1994. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk
Perbanyakan Tanaman secara Vegetatif- Modern. Yogyakarta : Kanisius.