BAB III

METODE KERJA

3.1 Waktu dan Tempat

Kuliah Kerja Praktik (KKP) ini dilaksanakan pada tanggal 1 Juli – 3 Agustus
2019 di Laboratorium Kultur Jaringan UPT. Benih Induk Hortikultura Gedung Johor,
Dinas Pertanian Provinsi Sumatera Utara.

3.2 Ruang Lingkup Kerja

Ruang lingkup kerja yang dilakukan pada Kuliah Kerja Praktik (KKP) ini yaitu
sterilisasi ruangan, sterilisasi alat dan bahan, pembuatan larutan stok, pembuatan media,
sterilisasi media, pengambilan eksplan, sterilisasi eksplan, inisiasi eksplan, subkultur
dan aklimatisasi planlet di screen house.

3.3 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan selama KKP berlangsung yaitu: LAFC (Laminar Air
Flow Cabinet), autoklaf, timbangan analitik, lemari pendingin, oven, hot plate and
magnetic stirrer, kompor gas, gelas ukur, Erlenmeyer, cawan petri, gelas kimia, batang
pengaduk, botol kultur, alat-alat diseksi (scalpel, pinset, gunting), spatula, pipet volume,
lampu bunsen, sprayer, pH meter, rak kultur, kertas label, panci stainleess steel, korek
api, alumunium foil, tissu, plastik wrap, kertas saring, kertas koran, ember, sikat botol,
pulpen, masker, troli wadah planlet dan kamera .
Bahan-bahan yang digunakan selama KKP berlangsung yaitu: eksplan tanaman
nilam (Pogostemon cablin Benth.) bagian tunas muda atau pucuk, detergen, fungisida,
bakterisida, aquadest atau air steril, Clorox (Bayclin) 15 %, alkohol 70 % , media MS
(Murashige & Skoog) instan, air minum isi ulang, Tween-80.

3.4 Metode dan Proses Kerja

3.4.1 Sterilisasi
3.4.1.1 Sterilisasi ruangan
Ruangan laboratorium disterilisasi dengan cara menyapu dan mengepel ruangan
serta meja kerja secara keseluruhan dengan mengguanakan desinfektan agar terbebas
dari debu dan sampah. Kegiatan tersebut diulangi setiap hari sebelum dan sesudah
proses kultur jaringan dilaksanakan. Ruang tanam juga disterilisasi dengan
menggunakan sinar ultraviolet (UV) yang terdapat pada LAFC (Laminar Air Flow
Cabinet) selama dua jam setiap hari sebelum digunakan. Rak kultur disemprotkan
dengan alkohol 70% setiap hari untuk mematikan sumber kontamina.

3.4.1.2 Sterilisasi alat

a. Sterilisasi LAFC (Laminar Air Flow Cabinet)
Sterilisasi LAFC (Laminar Air Flow Cabinet) dilakukan dengan menyemprot
LAFC menggunakan alkohol 70 % lalu di lap dengan tissu. FAN dinyalakan untuk
mengalirkan udara agar ruang LAFC terbebas dari sumber kontaminan. Sinar
Ultraviolet yang terdapat pada LAFC dinyalakan selama 1-2 jam sebelum digunakan.

b. Sterilisasi peralatan kerja

Sterilisasi peralatan kerja seperti botol kultur, gelas kimia, cawan petri, gelas
ukur, Erlenmayer, alat-alat diseksi (scalpel, pinset, gunting) direndam selama 2-3 jam
dengan larutan sodium hipoklorit. Peralatan kerja selanjutnya dicuci bersih
menggunakan deterjen dan dikeringkan. Peralatan kerja seperti cawan petri dan alat-alat
diseksi (scalpel, pinset, gunting) dibungkus dengan menggunakan kertas, kemudian
semua peralatan kerja tersebut disterilkan menggunakan oven dengan suhu 180oC
selama 2 jam.

3.4.1.3 Sterilisasi bahan

a. Sterilisasi aquadest
Sterilisasi aquadest dilakukan dengan memasukkan air kemasan isi ulang
kedalam Erlenmeyer sebanyak 2/3 dari total daya tampung Erlenmayer. Aluminium foil
digunakan untuk menutup rapat Erlenmayer dan disterilkan menggunakan autoklaf
dengan suhu 121oC pada tekanan 15 Psi selama 1 jam.

b. Sterilisasi media
Sterilisasi media dilakukan pada media yang telah dimasak dan dimasukkan ke
dalam botol kultur sebanyak lebih kurang 20 ml dan ditutup rapat menggunakan tutup
botol. Media disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 oC pada tekanan 15
Psi selama 25-30 menit.

3.4.2 Pembuatan Larutan Stok

Larutan stok yang dibuat pada KKP ini adalah larutan stok MS. Zat kimia yang
dibutuhkan ditimbang sesuai takaran pada Gambar 3.1 dan dilarutkan dengan
menggunakan air steril. Larutan selanjutnya di homogenkan menggunakan magnetic
stirrer, jika larutan mempunya titik didih yang tinggi maka dihomogenkan
menggunakan hot plate. Larutan stok dimasukkan kedalam botol larutan stok yang telah
diberi label untuk mempermudah saat akan digunakan. Larutan stok selanjutnya
disimpan di dalam lemari pendingin.

Gambar 3.1 Takaran pembuatan larutan stok MS

(Sumber: Laboratorium UPT. BIH Gedung Johor)

3.4.3 Pembuatan Media

Media yang digunakan pada saat KKP ialah media Murashige & Skoog (MS).
Media MS yang dipakai dibuat dengan dua cara yaitu media MS dengan larutan stok
dan media MS instan. Pembuatan media MS dengan larutan stok diawali dengan
persiapan larutan stok. Pembuatan 1 liter media membutuhkan 10ml/L dari masing-
masing larutan stok, 30 g/L gula, 6 g/L agar dan 0,1 g/L askorbit. Pembuatan 1 liter
media MS instan membutuhkan MS instan 4,43 g/L, Glysin 0,2 ml/L, CAP 1ml/L , myo
inositol 0,1 g/L, agar 6 g/L, gula 30 g/L. Kedua media MS tersebut kemudian
ditambahkan air mineral isi ulang hingga komposisi media hingga mencapai 1 L.
Larutan media kemudian dihomogenkan menggunakan hot plate and magnetic stirer
dan diukur pH larutan menggunakan pH meter. NaOH ditambahkan sedikit demi sedikit
apabila pH media terlalu asam, sebaliknya HCl ditambahkan apabila media terlalu basa.
pH media yang sesuai adalah 6 dan pH akan menurun sekitar 4,5-5,8 setelah disterilisasi
dengan autoklaf. Media dipanaskan hingga benar-benar mendidih menggunakan
kompor gas dengan api sedang. Media kemudian dimasukkan kedalam botol kultur
yang telah disterilisasi terlebih dahulu sebanyak 20-25 ml per botol.1 L media dapat
digunakan untuk mengisi sebanyak 45 botol kultur. Media disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 Psi selama 25-30 menit. Media
dipindahkan ke dalam ruang kultur setelah sterilisasi selesai.

3.4.4 Alur Kerja Kultur Jaringan

3.4.4.1 Penyiapan eksplan
Eksplan tanaman nilam diambil dari koleksi screen house UPT. BIH Gedung
Johor. Eksplan tanaman nilam yang digunakan merupakan bagian pucuk atau tunas
muda dan batang yang memiliki tunas aksiler dari tanaman nilam dewasa yang berumur
4 bulan. Tanaman nilam dipotong sekitar 5-10 cm dari ujung pucuk. Tanaman nilam
dipotong lagi menjadi beberapa bagian kecil berukuran 1-1,5 cm pada setiap ruas yang
memiliki tunas muda, pemotongan ini harus dilakukan dibawah air mengalir.

3.4.4.2 Sterilisasi eksplan

Eksplan nilam yang telah dipotong kemudian dicuci bersih menggunakan air
mengalir. Eskplan direndam dalam larutan deterjen selama 15 menit sambil sesekali
dikocok dan dibilas hingga bersih menggunakan air mengalir. Eksplan selanjutnya
dimasukkan kedalam larutan fungisida lalu dibiarkan selama 15 menit sambil sesekali
dikocok, lalu dibilas menggunakan air mengalir dan dimasukkan kedalam air steril.
Sterilisasi selanjutnya dilakukan di LAFC. Eksplan disterilisasi lagi dengan
larutan clorox (bayclin) 15 % dalam 150 ml air steril dan ditambahkan 5 tetes Tween-80
lalu dikocok sebentar sebelum eksplan dimasukkan. Eksplan direndam dalam larutan
bayclin selama 15 menit sambil sesekali dikocok. Setelah 15 menit, eksplan dibilas
menggunakan air steril hingga benar-benar bersih. Eksplan dimasukkan kedalam air
steril sebelum ditanam agar eksplan tidak kering.

3.4.4.3 Inisiasi
Proses penanaman dilakukan dengan mengambil tunas muda tanaman nilam ,
kemudian dibedah menggunakan alat diseksi yaitu pinset dan scalpel untuk membuang
bagian yang tidak dibutuhkan seperti daun yang telah dewasa dan menyesuaikan ukuran
tunas nilam agar seragam ketika ditanam. Eksplan nilam selanjutnya ditanam pada
media inisiasi yaitu media MS (Murashige & Skoog) dan bibir botol disterilkan lagi
menggunakan lampu bunsen, kemudian ditutup menggunakan tutup botol serta
dibungkus dengan plastik wrap. Botol-botol tersebut diletakkan di rak kultur dan di
semprot menggunakan alkohol 70%. Lampu rak dinyalakan dengan pencahayaan
sepanjang waktu.

3.4.4.4 Subkultur
Subkultur dilakukan terhadap kalus atau planlet nilam yang telah kekurangan
nutrisi dan mulai menunjukkan gejala kematian sebelum waktunya aklimatisasi.
Subkultur dilakukan di LAFC (Laminar Air Flow Cabinet). Peralatan kerja disiapkan
sebelum proses subkultur dilakukan seperti lampu bunsen, cawan petri, alat diseksi
yang telah disterilkan dan alkohol 70% diletakkan di dalam LAFC. Lampu bunsen
dihidupkan dan cawan petri diletakkan di dekatnya, alat diseksi di rendam di dalam
alkohol 70% dan disterilisasi di atas lampu bunsen sebelum digunakan.
Tanaman yang akan disubkultur dikeluarkan dari botol kultur dan diletakkan di
atas cawan petri yang berada di dekat lampu bunsen untuk mencegah kontaminasi.
Kalus atau planlet nilam yang kondisinya masih baik dipisahkan dari kalus atau planlet
nilam yang telah mati atau menunjukkan gelaja kematian menggunakan pinset dan
scapel steril. Kalus atau planlet nilam yang kondisinya masih bagus dipindahkan ke
dalam media baru dengan jumlah 4-5 planlet per botol atau 1-3 kalus per botol
disesuaikan dengan ukuran kalus. Botol kultur yang telah selesai penanaman,
disterilisasi menggunakan lampu, tutup botol juga disterilkan lagi menggunakan lampu
bunsen selama beberapa detik sebelum menutup botol kultur. Tutup botol kemudian
direkatkan lagi menggunakan plastik wrap untuk mencegah sumber kontaminan masuk
melalui celah tutup botol. Botol kultur selanjutnya diletakkan di rak kultur dan
diinkubasi di ruang kultur dengan suhu 28oC dengan pencahayaan sepanjang waktu.

3.4.4.5 Aklimatisasi
Proses aklimatisasi planlet nilam pada kegiatan KKP ini hanya berdasarkan
penjelasan dari staf UPT. BIH Gedung Johor. Berdasarkan paparan staf UPT. BIH
Gedung Johor, aklimatisasi dilakukan terhadap planlet nilam berusia 5,5 - 6 bulan atau
telah sempurna pembentukan akar maupun pucuknya. Proses aklimatisasi diawali
dengan penyiapan media tanam. Media tanam untuk aklimtisasi planlet nilam adalah
media tanah yang dicampur dengan pupuk kompos dan arang sekam dengan
perbandingan 1:1:1. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam polybag untuk
selanjutnya siap sebagai media aklimatisasi.
Aklimatisasi selanjutnya dilakukan dengan menyiapkan planlet nilam. Planlet
dikeluarkan dari botol kultur dan dibersihkan dengan air mengalir untuk menghilangkan
sisa media agar yang menempel pada planlet. Planlet selanjutnya direndam dengan
campuran larutan fungisida dan bakterisida selama 25-30 menit untuk mengurangi
resiko kontaminasi mikroba lalu dikeringanginkan. Planlet selanjutnya ditanam pada
media yang telah disiapkan dan diletakkan didalam screen house. Penyiraman Planlet
disesuaikan dengan kondisi lingkungan, jika cuaca hujan maka planlet hanya disiram
satu kali sehari atau tidak disiram sama sekali, namun jika cuaca cerah maka planlet
disiram dua kali sehari pada pagi dan sore hari.