BAB III

METODOLOGI

3.1. Waktu Dan Tempat Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada Jumat, 10 Maret 2023. Tempat

pengambilan sampel yaitu di Kecamatan Alak, Kota Kupang. Sampel yang diambil
berupa swab rektal dan usus ayam Kampung Unggul Balitbangtan (Ayam KUB).
Selanjutnya isolasi dan identifikasi dilakukan di Laboratorium Program Studi
Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran dan Kedokteran Hewan, Undana.

3.2. Materi Praktikum

3.2.1. Alat dan Bahan
a) Alat

Cawan petri  Gelas piala

Timbangan  Objek glass
Ose  Pingset
Bunsen  Gunting
Erlenmeyer  Rak tabung
Autoclaf  Kapas
 Microwave  Pipet tetes
 Penangas listrik dan batang  Biobase
magnet pengaduk  Water bud
 Inkubator  Kertas label
 Semprot Alkohol  Pena
 Gelas beaker
3.2.2. Bahan

 MacCONKAY Agar (MCA) 2: Lugol, Eter Alkohol,

 Eosin Methylen Blue Agar Reagensia 3: Fushin
(EMBA) (Safranin)).
 Triple Sugar Iron Agar (TSIA)  Aluminum foil
 Sulfide Indol Motility (SIM)  Spritus
 Simmon Citrate Agar (SCA)  Reagen kovac’s
 Aquades dan Alkohol  Tissue
 H2O2  KOH 3%
 Pewarnaan Gram (Reagensia
1: Gentian Violet, Reagensia
3.3. Prosedur pemeriksaan
3.3.1. Pengambilan sampel
Koleksi sampel dilakukan melalui swab rectal dan pada usus ayam yang
sakit. Setelah itu dituangkan NaCl ke dalam Container swab untuk
ditransportasikan. Setelah itu sampel dimasukkan kedalam freezer guna agar
bakteri tidak berkembang ataupun mati.
3.3.2. Pembuatan Media
a. Media MacCONKAY Agar (MCA)
 Timbang media MCA sebanyak 2,08 gram, dan dimasukan kedalam botol
media atau erlen meyer yang telah disterilkan
 Tmbahkan Aquades sebanyak 40ml ke dalam botol yang berisi media
 Homogenkan, kemudian dipanaskan pada pemanas litrik dan alat
penganduk magnet selama 5 menit
 Media dimasukkan kedalam microwave selama 10-30 detik
 Setelah itu media inkubasi di dalam autoclaf sampai suhu mencapai 121°C
smapi 15 menit.
 Media di dinginkan sampai ±45°C
 Setelah itu media di tuang pada cawan petri dan dibiarkan memadat
kemudian dimasukkan kedalam Inkubator selama 24 jam dengan suhu
37°C
 Setelah media diinkubasi, bakteri di isolasi dengan streaking bakteri
dengan prosedur yang aseptis, setelah itu diinkubasikan pada suhu 37 oC
selama 24 jam.
 Dilanjutkan dengan pengamatan, atau dengan lanjutan uji biokimia

b. Media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA)

 Timbang media EMBA sebanyak 1,5 gram, dan dimasukan kedalam botol
media atau erlen meyer yang telah disterilkan
  Tmbahkan Aquades sebanyak 40ml ke dalam botol yang berisi media
 Homogenkan, kemudian dipanaskan pada pemanas litrik dan alat
penganduk magnet selama 5 menit
 Media dimasukkan kedalam microwave selama 10-30 detik
 Setelah itu media inkubasi di dalam autoclaf sampai suhu mencapai 121°C
smapi 15 menit.
 Media di dinginkan sampai ±45°C
 Setelah itu media di tuang pada cawan petri dan dibiarkan memadat
kemudian dimasukkan kedalam Inkubator selama 24 jam dengan suhu 37°C
 Setelah media diinkubasi, bakteri di isolasi dengan streaking bakteri dengan
prosedur yang aseptis, setelah itu diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24
jam.
 Dilanjutkan dengan pengamatan, atau dengan lanjutan uji biokimia

c. Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

 Timbang media TSIA sebanyak 0,6 gram, dan dimasukan kedalam botol
media atau erlen meyer yang telah disterilkan
 Tmbahkan Aquades sebanyak 10ml ke dalam botol yang berisi media
 Homogenkan, kemudian dipanaskan pada pemanas litrik dan alat
penganduk magnet selama 5 menit
 Media dimasukkan kedalam microwave selama 10-30 detik
 Setelah itu media inkubasi di dalam autoclaf sampai suhu mencapai 121°C
smapi 15 menit.
 Media di dinginkan sampai ±45°C
 Setelah itu media di tuang pada tabung reaksi dan dibiarkan memadat
kemudian dimasukkan kedalam Inkubator selama 24 jam dengan suhu 37°C
 Setelah media diinkubasi, bakteri di isolasi dengan streaking bakteri dengan
prosedur yang aseptis, setelah itu diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24
jam.
 Dilanjutkan dengan pengamatan.
d. Media Sulfide Indol Motility (SIM)

 Timbang media SIM sebanyak 0,3 gram, dan dimasukan kedalam botol
media atau erlen meyer yang telah disterilkan
 Tmbahkan Aquades sebanyak 10ml ke dalam botol yang berisi media
 Homogenkan, kemudian dipanaskan pada pemanas litrik dan alat
penganduk magnet selama 5 menit
 Media dimasukkan kedalam microwave selama 10-30 detik
 Setelah itu media inkubasi di dalam autoclaf sampai suhu mencapai 121°C
smapi 15 menit.
 Media di dinginkan sampai ±45°C
 Setelah itu media di tuang pada tabung reaksi dan dibiarkan memadat
kemudian dimasukkan kedalam Inkubator selama 24 jam dengan suhu 37°C
 Setelah media diinkubasi, bakteri di isolasi dengan streaking bakteri dengan
prosedur yang aseptis, setelah itu diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24
jam.
 Dilanjutkan dengan pengamatan

e. Media Simmon Citrate Agar (SCA)

 Timbang media SIM sebanyak 0,3 gram, dan dimasukan kedalam botol
media atau erlen meyer yang telah disterilkan
 Tmbahkan Aquades sebanyak 10ml ke dalam botol yang berisi media
 Homogenkan, kemudian dipanaskan pada pemanas litrik dan alat
penganduk magnet selama 5 menit
 Media dimasukkan kedalam microwave selama 10-30 detik
 Setelah itu media inkubasi di dalam autoclaf sampai suhu mencapai 121°C
smapi 15 menit.
 Media di dinginkan sampai ±45°C
  Setelah itu media di tuang pada tabung reaksi dan dibiarkan memadat
kemudian dimasukkan kedalam Inkubator selama 24 jam dengan suhu 37°C
 Setelah media diinkubasi, bakteri di isolasi dengan streaking bakteri dengan
prosedur yang aseptis, setelah itu diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24
jam.
 Dilanjutkan dengan pengamatan
f. Langkah Pewarnaan Gram
 Ambil isolat bakteri menggunakan ose steril dan letakan pada objek glass
dan teteskan NaCl
 Preparat difiksasi di bawah api bunsen
 tuang pada sediaan tersebut zat warna kristal violet, biarkan 1 menit
 Membuang larutan crystal violet pada preparat apus dan membilas perlahan
dengan air mengalir. Pembilasan dengan air mengalir dilakukan pada sisi
ujung slide dan bukan diarahkan langsung di atas preparat.
 beri larutan lugol, biarkan 1 menit
 lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan air selanjutnya dicuci dengan
alkohol 96% sampai tak ada lagi zat warna yang terlarut
 cuci dengan air sampai bersih
 tuangkan larutan safranin dan biarkan 1 menit, lalu cuci dengan air bersih
 keringkan dengan kertas saring
 periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x (pakai minyak
imersi) (Suarjana, et al., 2017).