BAB III

METODE PERCOBAAN

A. Waktu dan Tempat

Percobaan ini dilaksanakan pada hari selasa, 31 Mei 2022 pukul

08.00-10.00 WITA. Praktikum dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Sains

dan Teknologi Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu autoklaf, oven, inkubator,
sentrifuge, lemari pendingin, shaker, mikrosokop, neraca analitik, termometer, alat-alat

gelas, mikropipet, kaca preparat, bunsen, sendok tanduk, cawan petri, jarum, ose, botol

sampel steril dan botol semprot.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu akuades (H2O), alkohol

70%, aluminium foil, ammonium sulfat (NH4)2SO4, garam iodium, kalsium klorida

(CaCl2), kalsium karbonat (CaCO3), kristal violet, kertas pH universal, larutan iod (I2),

magnesium sulfat heptahydrate (MgSO4.7H2O), monopotassium fosfat (KH2PO4),

natrium klorida (NaCl), natrium nitrat (NaNO3), pepton, safranin, spiritus dan yeast

ekstrak.

C. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Agar

Dilarutkan yeast ekstrak 0,2% 0,1 gram, pepton 0,5%, NaCl 0,1 gram,

MgSO4.7H2O 0,01 gram, amilum 0,5 gram, nutrient agar 1,25 gram, KNO3 0,35 gram

17
 18

dan KH2PO4 0,25 gram dengan akuades hingga volume akhir 100 ml. kemudian

dipanaskan larutan dan disterilkan dalam autoklaf. Setelah itu didinginkan dan dituang

ke dalam cawan petri.

2. Pembuatan Media

Dididihkan nutrient agar agar selama 5 menit. Kemudian didinginkan nutrient

hingga 50°C dan jaga suhunya selama 5 menit. Setelah itu, dilepas tutup tabung dan

dibakar ujung tabung yang terbuka. Dituangkan isi tabung pada cawan petri dan tabung
reaksi kemudian dibiarkan hingga memadat.

3. Peremajaan Bakteri
Diberikan label pada tabung stok awal. Kemudian dikocok stok awal dan

dipijarkan jarum ose. Setelah itu, dibuka tutup tabung cawan dan dipijarkan mulut

tabung. Selanjutnya didinginkan jarum ose dan diambil bakteri pada stok awal.

Kemudian digoreskan bakteri pada tabung cawan. Setelah itu, dipijarkan mulut tabung

dan ditutup ulang tabung. Kemudian disimpan isolat bakteri di inkubator.

4. Pewarnaan Gram

Dibilas kaca preparat dengan akuades. Kemudian dilap dengan tissu setelah itu
dibilas kaca preparat dengan etanol. Selanjutnya dilap dengan tissu. Kemudian

dilingkari bagian yang akan disebar bakterinya. Dibalik kaca preparate yang telah

dilingkari. Selanjutnya disebar bakteri kedalam lingkaran yang telah ditandai. Setelah

itu dihomogenkan dengan akuades dan ditunggu hingga kering. Kemudian difiksasi di

atas Bunsen sebanyak tiga kali dan ditambahkan kristal violet lalu ditunggu selama 1

menit. Kemudian dicuci dengan akuades dan ditambahkan dengan iod (I2) lalu

ditunggu selama 1 menit. Selanjutnya dicuci dengan etanol lalu ditunggu selama 1

menit dan dibilas dengan akuades. Setelah itu, ditambahkan dengan safranin lalu
 19

ditunggu selama 1 menit dan dicuci dengan akuades lalu dikeringkan dan diamati

dibawah mikroskop.