Bakteriologi dan Mikologi

Nama : Yansi Martha Maromon

Nim : 2009010033
Tugas : Isolasi dan Identifikasi Bakteri

SOAL
1. Uraikan dan jelaskan prosedur isolasi dan identifikasi bakteri escherichia coli.jelaskan
peralatan yang dibutuhkan,media kultur yang digunakan.

JAWABAN
1. identifukasi bakteri escherichia coli peralatan dan media yang digunakan
A. identiikasi bakteri
1) enteroinvasive escherichia coli
menyebabkan penyakit yang mirip dengan shigellosis dengan
penyerangan sell epitel mukosa usus.

2) Enteroagregative escherichia coli

Menyebabakan diare yang akut dan kronis(dalam jangka waktu
lebih dari 14 hari)dengan cara melekat pada mukosa
intestinal,menghasilkan enterotoksin dan sitotoksin,sehingga terjadi
kerusakan mukosa,pengeluarran sejumlah besar mukosa,pengeluaran
sejumlah besar mukus,dan terjadi diare.

3) Enteropathogenic escherichia coli

merupakan penyebab penting diare pada bayi,infeksi ini trjadi saat
lahir dengan cara ssel bakteri menempel ke mukosa usus halus yang
nantinya menyebabkabn muall,muntah demam dan diare
 berair..patogenesis awalnya dengan menempel Enteropathogenic
escherichia coli ke enterosit usus haluss dengan vili “bundle-forming”,lalu
lesi berkembang dengan regenerasi brush broder lokal,kehilangan
mikrovilia,dan perubahan pada morfologi sel.pada akhirnya akan
menyebabkan kerusakan mitokondria.

4) Enterotoxigenic Escherichia coli

Beberapa strain Enterotoxigenic escherichia coli memproduksi
eksotoksin yang sifatnya labil terhadap panas dan toksin yang stabil
terhadap panas infeksi enterotoxigenic escherichia coli dapat
mengakibatkan gejalah sakit perut,muntah dan pada fase diitemukan darah.

5) Enterohemorrhagic Escherichia coli

Serotipe Escherichia coli yang memproduksi verotoksin yaitu
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157H7.Enterohemorrhagic
Escherichia coli memproduksi toksin yang sifatnya hampir sama dengan
toksin serangga yang diproduksi oleh stain shingella
dysenteriae.verotoksin yang dihasilkan menghancurkan dinding mukosa
menyebabkab pendarahan.

B. Peralatan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gels beker(250
ML,500 ML, dan 1000 ML),tabung erlenmeyer(500 ML),tabung ukur(100
ML,500 ML),tabung reaksi,rak tabung reaksi,cawan
petri,bunsen,spatula,pinset,pipet,ose,batang L,korek api,tip,(1000 μL dan
100μL),mikropipet(1000μL),blender,autoklaf,oven,inkubator,kulkas,laminar,vorte
x,timbangan,hot plate,maknetic stir,tisu,kapas,handscoom,masker,minyak
immerse,mikroskop,dan swab kapas kering.
Gambar alat yang digunakan
C. Media yang digunakan
1. Pembuatan Media NB dan Pengenceran
Media NB ditimbang sebanyak 4 gr, lalu dimasukkan ke dalam gelas beker yang
telah berisi akuades 306 mL, kemudian panaskan pada hotplate selama ± 15 menit,
150˚C. Setelah itu masukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 9 mL
sebanyak 14 tabung dan masing-masing 90 mL pada 2 tabung erlenmeyer 250 mL
dan tutup semua tabung dengan kapas. Masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam
plastik lalu sterilisasi bersama tabung erlenmeyer di autoklaf selama ± 1-2 jam,
kemudian masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3
Setelah media siap digunakan persiapkan sampel, yaitu dengan
memblender sampel sampai halus dan tercampur, lalu sampel ditimbang dengan
ukuran 10 gram, kemudian disiapkan 7 tabung yang berisi masing-masing 9 mL
NB dan media NB 90 mL dalam tabung erlenmeyer. Kemudian sampel sebanyak
10 gr dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer berisi 90 mL NA divortex sampai
homogen, setelah homogen ambil 1 ml campuran NB dan sampel dengan
menggunakan menggunakan tip 1000 μL dan dimasukan pada tabung reaksi ke-1
dengan pengenceran 10-1. Dari tabung reaksi ke-1 yang telah berisi media NB 9
mL dan sampel 1 mL di vortex hingga homogen dan diambil 1 ml dengan
mengunakan tip 1000 μL dan dimasukan pada tabung ke-2, lalu di vortex hingga
homogen. Dilakukan hal yang sama pada tabung-tabung selanjutnya sampai
dengan tabung ke-6. Pada tabung ke-7 isi dengan 9 mL NB tanpa sampel yang
nantinya digunakan sebagai kontrol negatif.
2. Pembuatan Media NA dan Penanaman Sampel
Media NA ditimbang sebanyak 8 gr, lalu dimasukkan ke dalam gelas
beker yang telah berisi akuades 560 mL, kemudian panaskan pada hotplate selama
± 20 menit, 150˚C. Setelah itu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 500 mL dan
tutup dengan kapas, kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Setelah itu,
tuang media ke dalam cawan petri masing-masing ± 20 mL dan dinginkan, bila
telah mengeras masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C.

Setelah tahap pengenceran, ambil 0,1 mL dengan mikropipet diambil dari

tabung reaksi yang telah di vortex ulang dengan konsentari 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-
5
(sesuai dengan koloni bakteri yang dihasilkan) dan kontrol negatif. Ambil 0,1
mL dan diletakkan pada 2 cawan petri lalu diberikan label sesuai dengan
pengenceran, contoh: 1-1, 1-2 sampai dengan 4-1, 4-2. Pada kontrol negatif,
teteskan 0,1 mL NB dari tabung reaksi ke 7 lalu diletakkan pada satu cawan petri
dan diberi label “kontrol”. Rendam batang L dalam larutan alkohol, lalu setiap
akan digunakan keluarkan batang L dari larutan alkohol, kemudian dilewatkan
diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak panas kemudian goreskan
batang L diatas media untuk meratakan larutan sampel yang telah diteteskan.
Kemudian inkubasi cawan selama 24 jam, lalu lakukan hitung jumlah koloni yang
terbentuk.masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL dan tutup dengan kapas.
Setelah itu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian tuang media ke
dalam cawan petri masing-masing ±20 mL dan dinginkan, bila telah mengeras
masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C
Setelah tahap pengenceran dan penanaman larutan sampel pada media NA.
Ambil 0,1 mL dengan menggunakan mikropipet pada tabung reaksi dengan
pengenceran 10-1, lalu diletakkan pada media EMB. Rendam batang L dalam
larutan alkohol, lalu setiap akan digunakan keluarkan batang L dari larutan
alkohol, kemudian dilewatkan diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah
tidak panas kemudian goreskan batang L diatas media untuk meratakan larutan
sampel yang telah diteteskan. Kemudian cawan diinkubasi selama 24 jam, setelah
itu amati koloni yang tumbuh yang selanjutnya dilakukan pewarnaan dan uji
biokimia.

3. Pembuatan Media SSA dan Penanaman Sampel

Masukkan akuades 40 mL ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL dan tutup
dengan kapas, lalu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Timbang media SSA
sebanyak 2,4 gr, lalu masukkan media SSA ke dalam tabung erlenmeyer yang
 telah di sterilisasi, kemudian dipanaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150˚C.
setelah itu, tuang media ke dalam cawan petri masing-masing ±20 mL dan
dinginkan, bila telah mengeras masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C.
Setelah tahap pengenceran dan penanaman larutan sampel pada media NA.
Ambil 0,1 mL dengan menggunakan mikropipet pada tabung reaksi dengan
pengenceran 10-1, lalu diletakkan pada SSA. Rendam batang L dalam larutan
alkohol, lalu setiap akan digunakan keluarkan batang L dari larutan alkohol,
kemudian dilewatkan diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak
panas kemudian goreskan batang L diatas media untuk meratakan larutan sampel
yang telah diteteskan. Kemudian cawan diinkubasi selama 24 jam, setelah itu
amati koloni yang tumbuh yang selanjutnya dilakukan pewarnaan dan uji
biokimia.

4. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram

Bakteri yang telah tumbuh di media spesifik EMB Agar, dan SSA
dilakukan pewarnaan Gram. Mula-mula panaskan ose di atas api, ambil NaCl
dengan menggunakan ose dan teteskan di atas kaca objek yang telah diberi batas
bentuk oval dibagian bawahnya dengan spidol. Panaskan ose di atas api kembali,
dinginkan dan ambil koloni bakteri dalam cawan media lalu oleskan pada kaca
objek dan ratakan dengan NaCl yang telah diteteskan sebelumnya (tidak melewati
batas). Keringkan dengan dilewatkan di atas api 2-3 kali atau diamkan hingga
mengering dengan sendirinya. Teteskan Gentian Violet atau Kristal Karbol Ungu
(KKU), diamkan selama 5 menit, bilas dengan air mengalir. Teteskan lugol,
diamkan selama 3 menit, bilas dengan air mengalir. Teteskan alkohol 96%, hingga
tidak ada lagi larutan ungu yang luntur. Teteskan safranin, diamkan selama 45
detik hingga 1 menit, bilas dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan
tisu kering dengan tidak mengusap bagian atas gelas objek. Teteskan minyak
immersi, lihat di bawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100x
D. UJI BIOKIMIA
1. Fermentasi Karbohidrat
Fermentasi merupakan proses oksidasi secara anaerob yang membutuhkan
karbohidrat sebagai substratnya. Fermentasi karbohidrat harus mengandung senyawa yang
bisa dioksidasi dan difermentasi oleh bakteri, hasil dari proses fermentasi berbeda-beda
tergantung sifat dari tiap bakteri. Ka v vcdrbohidrat yang sering digunakan dalam uji ini
adalah glukosa, laktosa, maltosa, mannitol, dan sukrosa.
Kaldu karbohidrat digunakan untuk mengetahui apakah bakteri menghasilkan asam
dan gas, untuk mengetahui proses fermentasi menghasilkan asam bisa dideteksi dengan
cara melihat apakah terjadi penurunan pH dengan menggunakan indikator. Indikator yang
digunakan biasanya brom timol biru atau brom kresol ungu.
Jika terjadi penurunan pH maka akan terjadi perubahan warna media menjadi
warna kuning, tetapi jika pH diatas 7 maka akan berwarna biru pada brom timol biru atau
ungu pada brom kresol ungu. Selain uji pembentukan asam setelah proses fermentasi,
pembentukan gas juga diuji dan untuk itu digunakan tabung durham yang bila terbentuk
gas maka gas akan masuk ke dalam tabung durham dan akan terlihat seperti gelembung
udara yang terperangkap dalam tabung durham. Setelah masa diinkubasi maka dapat
diamati perubahan warna dan pembentukan gas dalam tabung yang bisa digunakan
sebagai acuan dalam identifikasi bakteri.

a) tidak ada inokulasi

b) Positif
c) negatf
2. Uji MR-VP
Tujuan uji MR yaitu untuk mengetahui apakah bakteri mampu untuk menggunakan
glukosa monosakarida heksosa sebagai substrat utama untuk menghasilkan energi pada
mikroorganisme enterik, hasil akhir dari produksi energi akan bervariasi setiap
mikroorganisme. Tes MR akan mendeteksi tingginya konsentrasi asam sebagai produk
akhir. Indikator MR akan berubah menjadi merah pada kisaran pH 4,pada pH 6 tetap
akan menunjukkan adanya asam tetapi dengan sedikit konsentrasi ion hidrogen dan
indikator akan berubah menjadi warna kuning yang berarti negatif.
Tujuan uji VP yaitu untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk menghasilkan
produk akhir yang bersifat tidak asam atau ber-pH netral seperti asetil metil karbinol.
Reagen yang digunakan pada test ini menggunakan reagen Barrit yang berisi campuran
alkohol α-naftol dan 40% larutan potasium hidroksida (KOH). Reaksi ini bisa terjadi
dengan adanya katalis α-naftol dan kelompok guanida yang ada pada pepton di media
MR-VP, hasilnya berupa kompleks warna pink mawar. Hasil positif pada VP ditunjukkan
dengan adanya warna pink mawar yang bertahan sampai 15 menit saat ditambahkan
reagen Barrit, hasil negatif ditunjukan dengan tidak terjadi perubahan warna menjadi
pink mawar

a) Tidak ada inokulasi

b) Negatif
c) positif

3. Uji SIM
Media agar SIM mengandung substrat triptofan yang akan dikonversi
menjadi indol, asam piruvat dan amonia dengan bantuan enzim triptopanase.
Adanya produksi indol dideteksi dengan penambahan reagen Kovac yang
menghasilkan lapisan warna merah cherri.

Indol positif ditunjukkan dengan perubahan warna merah cherri saat

dilakukan penambahan reagen kovac. Dan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak

berubahnya warna SIM agar menjadi merah cherri saat penambahan

reagen Kovac yang menunjukkan tidak terjadinya hidrolisis triptofan.
 a) Tidak ada inokulasi

b) Negatif

c) positif

4. Uji Sitrat
Tujuan uji sitrat adalah untuk mengetahui apakah bakteri dapat menggunakan sitrat
sebagai sumber karbon untuk sumber energinya karena tidak bisa memfermentasi glukosa
dan atau laktosa. Kemampuan ini tergantung adanya permease sitrat yang berguna sebagai
transport sitrat masuk ke dalam sel, sitrat aktif saat terdapat enzim sitrase yang akan
memproduksi asam oksaloasetik dan asetat.
Produk tersebut kemudian secara enzimatik akan dirubah menjadi asam piruvat dan
karbon dioksida, selama proses ini media agar menjadi bersifat basa yang berasal dari
proses penggabungan karbon dioksida dengan sodium dan air yang membentuk sodium
bikarbonat yang bersifat basa. Keadaan basa ini akan mengubah indikator bromtimol blue
yang ada pada media agar menyebabkan perubahan warna dari hijau menjadi biru
Prussian gelap. Hasil positif sitrat setelah diinkubasi adalah dengan tumbuhnya koloni
pada bagian lereng disertai perubahan warna menjadi biru, hasil positif akan terlihat
dengan tidak adanya pertumbuhan koloni pada bagian lereng dengan warna hijau

a) Hasil negatif tidak ada pertumbuhan di lereng

b) Hasil positif ada pertumbuhan di lereng

5. Uji TSIA
Tujuan uji TSIA adalah untuk membedakan genus yang berbeda-beda dari
Enterobacteriaceae, yang semua termasuk dari bakteri batang Gram-negatif yang bisa
memfermentasi glukosa dengan memproduksi asam dan membedakan
Enterobacteriaceae dari bakteri batang Gram-negatif usus lainnya. Perbedaan terletak
pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi hidrogen sulfida. Untuk melihat pola
penggunaan karbohidrat, pada bagian lereng TSIA mengandung laktosa dan sukrosa
dengan konsentasi 1% dan glukosa dengan konsentasi 0.1 %. Indikastor asam basa juga
ditambahkan berupa phenol red untuk mengetahui fermentasi karbohidrat yang
diindikasikan dengan perubahan warna media dari merah-orange ke warna kuning yang
menandakan adanya produksi asam. Pada lereng TSIA dibutuhkan inokulasi dengan
prosedur “stab-and-streak” yang dilakukan dengan cara memasukkan ose jarum yang
streril secara lurus dari lereng ke dasar media TSIA.
Berikut hasil inkubasi aktivitas fermentasi bakteri
1) Lereng alkali (merah) dan dasar asam (kuning) dengan atau tanpa produksi gas
(pecahnya dasar agar). Hal ini menandakan hanya terjadi fermentasi glukosa dengan
pembentukan asam pada permukaan lereng yang dioksidadi secara cepat. Produksi
alkali muncul karena penggunaan pepton dalam media. Pada dasar TSIA reaksi asam
dipertahankan karena hasil dari penurunan tensi oksigen dan pertumbuhan yang
lambat dari bakteri.
2) Lereng asam (kuning) dan dasar asam (kuning) dengan atau tanpa produksi gas. Hal
ini menandakan telah terjadi fermentasi laktosa dan atau sukrosa. Karena 2 substansi
ini ada dengan konsentrasi yang tinggi maka akan digunakan juga sebagai substrat
untuk melanjutkan aktivitas fermentasi dengan mempertahankan reaksi asam baik
pada lereng maupun dasar.
3) Lereng alkali (merah) dan dasar alkali (orange-merah). Hal ini menandakan bahwa
tidak terjadi fermentasi, pepton mengalami katabolisme secara aerobik dan atau
aerobik yang mengakibatkan pH alkali karena asil dari produksi ammonia. Jika hanya
terjadi degradasi aerobik pada pepton maka reaksi alkali hanya terjadi pada bagian
lereng. Jika terjadi penggunaan pepton secara aerobik dan anaerobik maka reaksi
alkali ada pada bagian lereng dan dasar.

a) Tidak terjadi inokulasi

b) Lereng basa dan asam dengan H2S
c) Lereng basa dan daasar asam
d) Lereng asam dan sadar asam dengan gas
e) Lereng asam dan dasar asam