TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI

I. Tujuan
- Mempraktikkan teknik aseptik dan pembuatan biakan murni

II. Teori
Pemanfaatan mikroba dalam bioteknologi umumnya bergantung pada biakan
murni yang terdiri dari spesies tunggal, dan pemeliharaan kemurniannya. Sebagian besar
aplikasi bioteknologi modern melibatkan penggunaan biakan murni. Metoda yang paling
praktis dan bermanfaat untuk mendapatkan biakan murni adalah metoda “streak plate”,
dimana campuran biakan di sebar atau dioleskan pada permukaan medium sedemikan
rupa sehingga sel-sel tunggal menjadi terpisah satu sama lainnya. Masing-masing sel
tunggal akan tumbuh menjadi suatu koloni yang merupakan biakan murni, oleh karena
sel-sel yang tumbuh dalam koloni tersebut adalah keturunan dari sel tunggal.
Teknik aseptik diperlukan dalam bekerja dengan suatu biakan mikroba murni dan
untuk menjaga/memelihara kesterilan suatu media atau larutan. Dengan teknik aseptic,
ahli-ahli bioteknologi dapat mencegah kontaminasi biakan atau larutan oleh mikroba
yang tidak diinginkan. Banyak cawan petri dan plate kultur jaringan yang digunakan
untuk menumbuh-biakan mikroorganisme terbuat dari bahan yang telah disterilkan oleh
produsennya, pengisian peralatan-peralatan ini dengan media steril membutuhkan teknik
aseptic. Teknik aseptic yang benar juga melindungi peneliti di bidang bioteknologi dari
kontaminasi biakan-biakan yang berpotensi pathogen. Termasuk dalam teknik aseptic
adalah menghindari kontak antara biakan murni, media steril, dan permukaan steril
peralatan bejana dengan mikroorganisme kontaminan. Untuk mencapai tujuan ini :
1. Tempat kerja harus dibersihkan dengan larutan antiseptic untuk mengurangi jumlah
kontaminan potensial
2. Peralatan disterilkan sebagai contoh batang ose disterilkan melalui pemanasan
dengan pembakar Bunsen sebelum dan setelah transfer biakan
3. Pekerjaan dilakukan secara cepat dan efisien untuk mengurangi waktu kontak
dimana kontaminasi pada biakan atau pekerja laboratorium dapat terjadi
Langkah-langkah yang biasa dilakukan dalam transfer biakan dari satu
bejana/tabung ke bejana lain adalah sebagai berikut:
1. Menempelkan jarum ose ke api
2. Membuka dan menempelkan mulut tabung biakan ke api
3. Menggunakan jarum ose, sejumlah biakan diambil dan dipindahkan ke media segar
4. Menempelkan mulut tabung biakan kea pi dan tabung ditutup kembali
5. Menempelkan kembali jarum ose ke api
Teknik yang sama digunakan untuk inokulasi ke dalam cawan petri dan plate mikroskop,
kecuali bahwa tutup cawan dan plate tidak dibakar.
Pemahaman dan pengetahuan yang menyeluruh mengenai teknik aseptic dan prosedur
pemindahan biakan merupakan persyaratan awal untuk bekerja dengan kultur
mikrobiologi. Kita akan menghemat banyak waktu dan tenaga serta menghindari
kesalahan hasil jika aturan-aturan umum dicermati ketika bekerja dengan biakan.
1. Sterilkan selalu jarum inokulasi ose dengan pembakaran sebelum menggunakannya
dan memasukkannya ke bahan biakan.
2. Bekerja selalu dekat dengan api, bila perlu bibir tabung (bahan gelas) ditempelkan
pada api sebelum memasukkan jarum ose. Langkah ini akan merusakkan sel-sel
 kontaminan yang mungkin tersimpan pada bibir tabung saat transfer biakan
sebelumnya atau oleh hal lain.
3. Menjaga semua bahan biakan agar tertutup dengan baik. Jangan meletakkan penutup
tabung atau cawan petri di atas meja, karena hal ini akan memungkinkan
kontaminasi pada biakan. Ketika mentransfer koloni dari cawan petri, gunakan tutup
cawan sebagai pelindung dengan sedikit mengangkatnya sehingga jarum ose dapat
dimasukkan, tetapi permukaan media masih terlindung dari kontaminan-kontaminan
yang mungkin jatuh ke atasnya.
4. Jangan membiarkan penutup tabung atau cawan petri menyentuh apapun kecuali
wadah biakannya masing-masing. Hal ini akan mencegah kontaminasi terhadap
penutup dan biakan.
5. Gunakan cara yang tepat pada saat membuka dan memasang penutup.

III. Prosedur

III.1 Alat
 Batang inokulasi (jarum ose)
 Cawan petri
 Tabung reaksi tertutup 18x150 mm
 Laminar flow
 Lampu spirtus
 Inkubator pengocok (shaker)
 Inkubator (oven) 37oC
 Rak tabung reaksi

III.2 Bahan
 2x5 mL media LB cair
 Sampel: 5 mL biakan murni Acetobacter xylinum dalam LB cair
 Alkohol
 Kertas tissue

III.3 Prosedur Percobaan

Catatan Pemimpin Praktikum
Sehari sebelum percobaan, 5 mL LB cair diinokulasi dengan kultur E.
Coli. Inkubasi disertai pengocokan E. coli pada 37oC, 150 rpm.
Seluruh pekerjaan di bawah ini dilakukan di dalam kamar steril (laminar
flow). Ingat!! Bersihkan dan sterilkan ruang laminar sebelum dan setelah bekerja
di dalamnya.

A. Pembuatan LB Cair
1. Siapkan bahan LB dan aquades dengan perbandingan massa 1:40 kemudian
larutkan
2. Autoclave LB cair dan semua tabung reaksi di oven selama ±30 menit
B. Transfer Biakan
Hari ke satu
1. Pegang batang inokulasi (ose) antara ibu jari dan jari telunjuk, tempelkan bagian
kawat ose pada api lampu spirtus, bakar seluruh kawat hingga merah dan berpijar.
Biarkan kawat dingin selama 5-10 detik sebelum diteruskan ke langkah
berikutnya. Jangan kibaskan ose di udara.
2. Gunakan tangan anda yang bebas, ambil tabung yang mengandung biakan
Acetobacter dan perlahan-lahan kocok biakan untuk meratakan biakan. Buka tutup
tabung dan tempatkan pada jari kelingking yang bebas dari tangan yang
memegang jarum ose steril, kemudian bibir tabung dibakar pada pembakar spirtus.
3. Pegang tabung biakan dengan posisi miring, masukan ose steril dan pindahkan
sedikit biakan dari tabung ke kawat ose. Usahakan jarum ose tidak menyentuh
dinding tabung atau sisi bibir tabung selama proses pemindahan.
4. Bakar bibir tabung, dan dengan hati-hati ditutup kembali. Kemudian kembalikan
tabung biakan Acetobacter ke rak tabung reaksi.
5. Ambil tabung reaksi baru yang mengandung 5 mL LB cair steril. Buka dan
pindahkan tutup tabung dengan cara yang sama seperti tahap sebelumya dan
mulut tabung dibakar.
6. Masukkan jarum ose yang mengandung inokulum hidup ke dalam tabung yang
mengandung LB cair steril dan goncangkan kawat ose sehingga mikroorganisme
berpindah ke dalam medium. Keluarkan jarum ose dari dalam tabung.
7. Selanjutnya mulut tabung dibakar, ditutup kembali, dan diletakkan pada rak
tabung reaksi.
8. Kawat ose dibakar kembali untuk disimpan.
9. Berikan label pada tabung baru yang telah diinokulasi, dan tempatkan pada
inkubator pengocok, pada 37oC dengan pengocokan 150 rpm selama 1 malam.

Hari ke dua
1. Setelah inkubasi satu malam, keluarkan tabung dari inkubator.
2. Amati tabung dan gambarkan kondisinya.

IV. Potensi Bahaya

No. Alat Potensi Bahaya

1 Batang inokulasi Tertusuk
2 Cawan petri Pecah/patah
3 Tabung reaksi Pecah/patah
4 Laminar flow Meledak/terbakar
5 Lampu spirtus Meledak/terbakar/tumpah
6 Inkubator pengocok Meledak/terbakar/konselet
7 Inkubator (oven) Meledak/terbakar/konselet
8 Rak tabung reaksi Patah

No. Bahan Potensi Bahaya

1 Acetobacter Terpapar pada tubuh praktikan.
Kontaminasi laboratorium.
2 Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
 memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.

V. Format Laporan dan Pengumpulan

Transfer Biakan
Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum hidup
Acetobacter setelah diimkubasi 1 malam.
Gambar quadrant streak dan continuous streak
 Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum
hidup E. coli setelah diimkubasi 1 malam