BAKTERIOLOGI II
DISUSUN OLEH:
DOSEN PEMBIMBING :
Bastian, S.Si. T., M. Biomed
3. Inokulasi pada Media Selektif Mac Conkey Agar (MCA) Sebelum dilakukan
inokulasi, sebanyak 5-10 mL sampel urine disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 2.500-3.000 rpm. Sentrifugasi bertujuan mengendapkan materi lain
yang ada di dalam urine selain bakteri. Isolasi E. Coli dilakukan dengan
melakukan inokulasi sampel urine ke media diferensial Mac Conkey Agar
(MCA). Biakan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, kemudian dilakukan
pewarnaan Gram pada isolat-isolat terpilih (representatif) (Widianingsih dan
Jesus, 2018).
Hari Kedua
1. Pengamatan Morfologi Koloni secara makroskopis
2. Pembuatan Suspensi
a. Mengambil koloni yang terpisah pada media menggunakan ose bulat secara
aseptis
b. Larutkan kedalam NaCl 0,95% steril
c. Buat kekeruhan berdasarkan standard Mac Farland 0,5
3. Pewarnaan Gram
a. Buat sediaan suspensi diatas kaca objek, sebar menggunakan ose/lidi dengan
cara spiral dan di fiksasi (dilewatkan diatas api bunsen) atau didiamkan.
b. Setelah kering lakukan pewarnaan gram
c. Tambahkan gentian violet sampai menutup semua permukaan sedian dan
tunggu selama 1 menit
d. Bilas menggunakan aquadest
e. Tambahkan lugol sampai menutup semua permukaan sediaan dan tunggu
selama 30 detik
f. Bilas menggunakan aquadest
g. Tambahkan alkohol 96% sampai warna luntur
h. Tambahkan safranin sampai menutup semua permukaan sediaan dan tunggu
selama 2 menit
i. Bilas menggunakan aquadest dan keringkan
j. Sediaan diperiksa menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x dan
tambahkan oil imersi. Ditemukan bakteri berbentuk batang, dan tersusun
menyebar.
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengetahui kelompok bakteri yang ada dalam
sampel urine (Widianingsih, 2018). Hasil mikroskopis pewarnaan gram
didapatkan (Gram (-), basil (+)). Identifikasi secara mikroskopis, bakteri terlihat
berbentuk basil, ada yang individu, saling berpasangan dan berkoloni membentuk
rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, motil, tidak motil, dan
peritrikus. Bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif (Elfidasari, dkk 2011).
4. Uji Biokimia
a. Tes Media SIM (Sulfide Indole Motility)
- Sebanyak 3 g medium SIM dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dibuat
dengan pH 7,3.
- Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen.
- Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing- masing
sebanyak 25 mL.
- Selanjutnya mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan
menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu
121ºC dan tekanan 2 atm selama 15 menit (Isnaeni dan Rahmawati, 2016).
b. Uji TSIA, H2s
Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan
diinokulasikan pada medium TSIA kemudian ditusuk bagian tengah TSIA
tegak. inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37ºc.
c. Uji Motility
Uji motilitas digunakan untuk melihat pergerakan bakteri. Dilakukan dengan
cara satu ose jarum bakteri ditanam secara tegak lurus di tengah Medium SIM
(Sulfit Indol Motility) dengan cara ditusukkan, diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam. Bila pertumbuhan koloni menyebar dan timbul kekeruhan
seperti kabut menandakan bakteri bergerak (Damayanti dkk, 2018).
d. Uji Indol
Satu ose biakan bakteri dari NA miring diinokulasikan ke dalam media, lalu
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37ºC, ditambahkan 0,2-0,3 ml
pereaksi indol ke dalam masing-masing tabung, kocok dan diamkan selama
beberapa menit. Warna merah cherry pada permukaan membentuk cincin
menandakan reaksi indol positif, warna jingga menunjukkan reaksi indol
negatif (Sari dkk, 2019).
e. Uji MR (Methyl Red)
Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan
diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya
diinkubasi selama 5x24 jam pada suhu 37ºC.Sebanyak 5 tetes methyl-red
ditambahkan di atas preparat isolat bakteri. Hasil positif apabila terbentuk
kompleks berwarna merah muda sampai merah yang menandakan bahwa
mikroba tersebut menghasilkan asam.
f. Uji VP (Voges Proskauer)
Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan
diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya
diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 37ºC. Medium kemudian ditambahkan
0,2 mL KOH 40% dan 0,6 mL alfanaftol lalu dikocok selama 30 detik. Hasil
positif jika medium berubah warna lembayung.
g. Uji Citrat
Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan dengan
cara sirsak kemudian di inkubasi selama 24 jam suhu 37ºC.
h. Uji Urea
Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan dengan
cara sirsak kemudian di inkubasi selama 24 jam suhu 37ºc.
Hari Ketiga
1. Pembacaan hasil
Tes Hasil Gambar Keterangan
Terbentuknya
Indol Positif cincin
merahpadam
edia
Terdapatramb
atan-
rambatandisek
Motility Positif itar
bekastusukan
jarumosepada
medium
Tidakmenamp
TSIA(H2s) akkanwarna
Negatif
hitampadamed
ia
Terjadiperuba
MethylRed
Positif hanwarnakem
erah
Tidakterjadipe
VogesPros
kauer Negatif rubahanwarna
Tidak
Citrat Negatif terjadiperubah
anwarnakemer
ah
Tidakterbentu
C. Pasca Analitik
Tahap pasca analitik adalah meliputi pelaporan dan validasi hasil (Rosita
dankhairani,2018)
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pasien
terkena infeksi E.Coli berdasarkan isolasi dan identifikasi bakteri yang telah
dilakukan (Kartikasari dkk,2019)