Praktikum ke I PENGENALAN ALAT-ALAT, MEDIA, STERILISASI DAN DEMONSTRASI MORFOLOGI KOLONI Penyusun : Sitti Zuleiha TUJUAN : Memperkenalkan alat-alat

yang digunakan untuk pemeriksaan mikrobiologi dan bermacam-macam media perbenihan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Dikemukakan sepintas tentang pembuatan serta penggunaan dari masing-masing media itu. Membiasakan mahasiswa untuk melakukan beberapa cara sterilisasi yang biasa dilakukan di laboratorium mikrobiologi terhadap alat-alat, media, dan lain-lain. Memperkenalkan morfologi berbagai koloni bakteri pada bermacam-macam media perbenihan. DISEDIAKAN : 1. Alat-alat yang digunakan di laboratorium Mikrobiologi antara lain : Inkubator (lemari pengeraman) = Inoculating cabinet (lemari penanaman) Hot Air Oven (Oven) = sterilisator kering Autoclave (Sterilisasi dengan tekanan uap air) Koch Stem sterilisator Water Bath Candle Jar Anaerobic Jar Sengkelit = Ose (Inoculating needle) Piring Petri Tabung kultur Biohazard (Biorisque Biogefahrding) dan alat-alat lainnya

2. Bermacam-macam media perbenihan: Agar Darah (Blood Agar) Agar Mc, Conkey Agar Coklat (chocolate Agar) Agar Nutrient Agar semisolid Nutrient broth Air Peptone (Peptone water) dan media lainnya

MEDIA : Media yang dipakai di Laboratorium Mikrobiologi : I. Media Transport : A. BGS (Buffered Glycerol Saline) B. Cary and Blair C. Amies II. Media untuk Isolasi : A. Kultur umum : 1. Agar Darah 2. Agar Coklat 3. DCLS (Deoxycholate Citrate Lactose Sucrose Agar) 4. Media Tellurit 5. Media untuk Pertussis (Bordet Gengou Agar) 6. Thayer Martin D. Air Peptone Alkalis E. Stuart F. Kaldu Peptone

7. Mc Conkey Agar B. Penanaman M. tuberculosis Lowenstein Jehnsen, Kudoh, Ogawa C. Penanaman bakteri Anaerob 1. Brucella Agar Darah 2. B.A.D dengan Kanamycin / Antibiotik lain 3. Agar Darah 4. Thioglycolat 5. Thioglycolat dengan Antibiotik D. Leptospira Fletchers Medium E. Mikologi Sabarouds Dextrose Agar (SDA), Potato Dextrose Agar (PDA) F. Enterobakteri : 1. DCLS 2. TCBS 3. Mc Conkey Agar III. Enriched Media (media penyubur) 1. Selenit Cystein Broth 2. Lar. Alkalin Peptone 3. Kaldu Darah IV. Media untuk Sensitivitas Test : 1. Mueller Hinton Agar 2. DST Agar 3. Supristol Agar 4. BHI (Brain Heart Infusion) 5. Agar Base 4. Thioglycolat 5. Gal Kultur

V. Media untuk Identifikasi : A. Kultur Umum : 1. Media gula-gula 2. Deret media complex K. P. Batang Gram ( ) B. Enterobakter : 1. TSI Agar 2. Semi Solid Suc. Medium (SSS) 3. Lysine Iron Agar (LIA) 4. Motility Indol Ornithine Medium (MIO) 5. Acetat Agar 6. Urea Broth 7. Methyl Red (MR) 8. VP (Voges Proskauer)

STERILISASI
PENDAHULUAN Sterilisasi adalah suatu usaha untuk menghapus-hamakan suatu bahan terhadap mikroorganisme dalam bentuk vegetatif atau bentuk spora. Alat-alat, media perbenihan dan lainlain yang dipergunakan harus disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Sterilisasi dapat dilakukan dengan 2 cara : 1. Cara fisika : a. Cara pemanasan 2. Cara kimia a. Desinfektan, yaitu bahan-bahan yang mempunyai kemampuan untuk membasmi b. Cara filtrasi c. Cara radiasi

mikroorganisme, tetapi bahan ini toksis (beracun) bagi tubuh. Bahan seperti ini digunakan untuk mensterilkan benda-benda mati : lantai dan alat-alat dari metal. Contoh : phenol, carbol dan lain-lain.

b.

Antiseptik, yaitu bahan-bahan kimia yang tidak begitu toksis yang digunakan untuk sterilisasi jaringan hidup.

Sterilisasi dengan : Pemanasan pilihan utama di rumah sakit a. Basah / lembab. Menggunakan Sterilisator Rasio standar : uap jenuh bertekanan, bebas udara. : autoclave : suhu / waktu untuk membunuh spora yang paling resisten : 121C, 1 atm, selama 15 menit. b. Kering : Menggunakan Sterilisator Rasio standar : udara panas : oven (Hot Air Oven) : suhu / waktu untuk membunuh spora yang paling resisten : 160 - 170C selama 1 2 jam. Gas Eto : Suhu < 10,8C : cair > 10,8C, menguap : gas

Suhu pada proses sterilisasi, biasanya : 55C Sterilisator : autoclave yang dimodifikasi Mudah terbakar dicampur dengan karbondioksida atau freon Bersifat : BAKTERISIDAL dan SPORISIDAL Untuk alat-alat / benda-benda : tidak tahan panas tinggi

Desinfeksi dengan Pemanasan : 1. Di bawah suhu 100C : Pasteurisasi Susu a. Holder method : 63 - 66 C selama 30 menit b. Flash method : 72 C selama 20 menit

untuk membasmi : M. tuberculosis M. bovis Brucella sp. C. burnetii L. monocytogenes Salmonella

c. Fudoskop speculum : 75 C selama 10 menit 2. Pada suhu 100 C a. Air mendidih : Merebus pada suhu 100 C Tekanan 1 atm 5 10 menit Untuk membunuh vegetatif bakteri Tyndalisasi suhu 100 C Tekanan 1 atm 3 hari berturut turut selama : 20 45 menit Untuk sterilisasi media perbenihan

b. Uap bebas

Desinfeksi dengan pemanasan basah pilihan utama di rumah sakit, kecuali terhadap jaringan hidup.

YANG DIKERJAKAN : Lakukan sterilisasi terhadap : Tabung-tabung kaca Alat-alat dari metal : pinset, gunting Larutan-larutan Media cair dan media agar Sarung tangan dari karet

Sangkelit Lantai

DISEDIAKAN : 1. Autoclave 4. Phenol 2. Koch steam sterilisasi 5. Formalin 3. Hot Air Oven 4. Nyala Api Busen

BUAT LAPORAN PEKERJAAN ANDA

DEMONSTRASI MORFOLOGI KOLONI PENDAHULUAN Satu sel bakteri yang tumbuh akan membelah diri menjadi suatu kelompok masa sel (multiplikasi) sehingga pada media padat akan membentuk satu koloni, sedangkan pada media cair akan mengeruhkan media cair tersebut dan terkadang membentuk selaput pada permukaan medium cair tersebut. Masing-masing spesies bakteri akan membentuk koloni yang berbedabeda bentuk, pinggir, ukuran serta sifatnya.

BAHAN PRAKTIKUM : Disediakan beberapa biakan bakteri pada media padat, media cair dan media semisolid.

YANG DIKERJAKAN : 1. Perhatikan dan buatlah laporan tentang : a. Bentuk koloni : - bintik-bintik (punctiform, pinpoint) - seperti benang (filamentous) b. Diameternya (dalam mm) c. Pinggir koloni : rata atau tidak rata d. Permukaan koloni : - halus - cembung (convex) - kasar - cekung (concave) - rata - umbilicated - bundar (circulair, round) - bentuk pohon (arborescent)

e. Kepadatan (opacity) dan konsistensi koloni : - kering - padat - seperti pasta - translucent - berlendir (mucoid)

f. Pembentukan pigment : warna pigmen dan apakah pigmennya larut kedalam media atau tidak. g. Perubahan medium : - penghancuran media - hemolisa atau tidak hemolisa pada agar darah

2. Gambarkan macam-macam bentuk koloni : buat laporan mengenai gambaran koloni pada medium padat maupun gambaran pada medium semisolid dan pada medium cair. 3. Laporkan apakah biakan itu murni atau bercampur (mixed)

KEPUSTAKAAN : 1. Finegoid, S.M. Martin W.J and Scott E.G : Bailey & Scotts, Diagnostic Microbiology 5 th ed. The C.V Mosby Company, St Louis 180-181. 1978. 2. Jawaetz E. Melnick J.L and Adelberg E.A : Rewiew of Medical Microbiology 14th ed. Lange Medical Publications / Maruzen Asia (Pte) Ltd. 239-241, 1980. 3. Lennette, E.H. balows A. Hausler, W.J Jr and Truant J.P. Manual of Clinical Microbiology, 3rd ed. Amer Society for Microbiol, Washington D.C. 1980. 4. Bagian Mikrobiologi FK UGM, Dasar- dasar Pemeriksaan Mikrobiologi hal. 30-31,1986.

Praktikum ke II PEWARNAAN Penyusun : Cherry Siregar

TUJUAN: Agar mahasiswa mengenal dan dapat mengerjakan pewarnaan dengan baik sehingga dapat mempelajari morfologi bakteri. Seperti diketahui, bakteri adalah transparan dan morfologinya sulit dilihat. Oleh sebab itu, untuk mempelajari morfologi, struktur serta sifat sifat bakteri dari spesimen penderita yang telah dikultur maupun dari sediaan langsung

spesimen tersebut, maka perlu dilakukan pewarnaan bakteri kemudian dilihat dibawah mikroskop. Untuk menyiapkan bakteri agar dapat diwarnai maka terlebih dahulu spesimen

dilekatkan ( fiksasi) pada permukaan gelas objek yang bersih dan bebas dari lemak. Fiksasi harus dilakukan sebaik mungkin agar hasil pewarnaan mudah diamati dengan mikroskop; yaitu bakteri tersebar rata, tidak terlalu tebal, tidak terdapat kotoran lain yang berasal dari gelas objek dan sediaan bakteri tidak terhapus atau terbuang prosedur pewarnaan selanjutnya.

PENDAHULUAN Pada pewarnaan digunakan zat warna bersifat basa seperti methylen blue, methylviolet, fuchsin air, safranin. Zat warna bersifat basa ini bermuatan listrik positif (kation) sehingga mampu mewarnai sel kuman dikarenakan sel kuman banyak mengandung asam nukleat (nucleic acid) dan fosfat yang bermuatan negatif (anion). Zat warna asam umumnya tidak dapat mewarnai sel kuman. Ukuran bakteri sangat kecil sehingga setelah dilakukan pewarnaan maka untuk pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Adapun jenis pewarnaan adalah : Pewarnaan sederhana Pewarnaan khusus Pewarnaan diferensial

Prosedur Pembuatan Hapusan Bakteri : 1. Bersihkan gelas objek dengan kain bersih agar tidak berlemak, gelas objek dilayang kan diatas nyala api

2. Setelah didinginkan, beri label dengan pensil kaca atau spidol 3. Teteskan satu tetes aquadest atau garam faal pada gelas objek 4. Pijarkan sengkelit kemudian dinginkan 5. Ambil sediaan yang hendak diwarnai dengan menggunakan sengkelit. Pada saat mengambil sediaan, hanya ujung sengkelit yang menyentuh koloni. 6. Suspensikan sediaan tersebut pada tetesan aquadest pada gelas objek lalu sebarkan dengan gerakan memutar agar rata. Luas sediaan 1-2 cm2 . Pijarkan kembali sengkelit yang dipakai untuk mengambil sediaan yang mengandung bakteri tadi 7. Sediaan dibiarkan mengering di udara, kemudian lewatkan diatas nyala api sebanyak 3 kali agar sediaan melekat sempurna di atas permukaan gelas objek (sisi gelas objek yang mengandung sediaan menghadap keatas agar tidak terkena nyala api).

A. PEWARNAAN SEDERHANA 1. Lakukan fiksasi dari koloni atau dari sediaan langsung 2. Lumuri dengan zat warna methylen blue sampai menutupi seluruh permukaan sediaan selama 30-60 detik 3. Cuci dengan air untuk menghilangkan zat warna yang berlebihan 4. Keringkan di udara dengan bantuan nyala api dan kertas saring. 5. Sediaan siap untuk dilihat dibawah mikroskop.

B. PEWARNAAN DIFERENSIAL I. PEWARNAAN GRAM Pewarnaan diferensial Gram sering dipakai pada pemeriksaan rutin . Pewarnaan Gram (Dr. Hans Christian Gram , 1884) dapat membedakan bakteri atas 2 golongan besar yaitu : 1. Bakteri Gram positif, yaitu bakteri yang berwarna ungu (oleh karena mampu menahan zat warna ungu terhadap zat peluntur).
2. Bakteri Gram negatif, yaitu bakteri yang berwarna merah (warna counter stain) oleh

karena zat peluntur melepaskan zat warna ungu lalu mengambil warna counter stain (fuchsin air, safranin).

Perbedaan ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada sel bakteri Gram positif, ikatan warna violet dengan jodium tidak dapat dilepaskan oleh peluntur alkohol atau aceton ; sedangkan pada bakteri yang Gram negatif, ikatan ini terlepas kembali sehingga protoplasma mengambil warna kedua ( counter stain).

Teknik Pelaksanaan Pewarnaan Gram : 1. Lakukan fiksasi ( seperti cara yang sudah diterangkan) 2. Tuang zat warna ungu kristal diatas sediaan : Jika memakai warna ungu kristal...................................................... Jika memakai karbol-gentian violet................................................... 3. Cuci sediaan dengan air kran.............................................................. 4. Genangi dengan larutan lugol............................................................. 5. Cuci sediaan dengan air kran............................................................. 6. Celup dan goyang dalam bak berisi alkohol 96%............................... Jika dalam aceton alkohol....................................................................... Jika dalam aceton.................................................................................... 7. Cuci sediaan dengan air kran 8. Genangi dengan fuchsin-air ( safranin) selama................................... 9. Cuci kembali dengan air kran, lalu keringkan diudara 10. Setelah kering, lihat dibawah mikroskop 1-2 menit 1 menit 5 menit 5-10detik 1 menit 5-10 detik 30 detik 10 detik 3 detik

II . PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM Bakteri tahan asam ( BTA ) sangat sukar diwarnai dengan zat warna anilin, akan tetapi dengan menggunakan larutan zat warna yang keras ( misalnya yang mengandung fenol) dan disertai pemanasan ( atau memasuki zat kimia tergitol), maka zat warna tersebut dapat masuk kedalam sel bakteri tersebut. Dan sekali zat warna memasuki sel bakteri tersebut maka zat warna sukar dilepaskan dengan menggunkana zat peluntur walaupun menggunakan pelarut yang kuat. Berdasarkan hal tersebut diatas, maka bakteri yang termasuk BTA , diwarnai dengan zat warna fuchsin basa ( basa fuchsin) yang mengandung fenol, kemudian dilunturkan dengan asam keras ( H2SO4 20% atau HCl 3% dalam alkohol 95% yang disebut asam alkohol).

Hasilnya bakteri tidak tahan asam akan melepaskan zat warna lalu mengambil zat warna kedua ( zat warna kontras), sedangkan bakteri BTA akan mempertahankan zat warna.

Pewarnaan Ziehl Neelsen (Pewarnaan BTA menurut Ziehl Neelsen)

CARA MEMBUAT SEDIAAN DAHAK

Spesimen dahak dengan bagian yang purulen (A) di dalam air liur (B)

A
Ambil contoh uji dahak pada bagian yang purulen

dengan lidi

Apuskan dahak di atas kaca sediaan pada permukaan yang sama dengan nomor identitas. Apusan bentuk oval 2x3 cm kemudian ratakan dengan gerakan spiral kecilkecil. Jangan membuat gerakan spiral bila sediaan dahak sudah kering karena akan menyebabkan aerosol. Keringkan di dalam suhu kamar

Ose yang telah digunakan dicelupkan dalam botol pasir disinfektan, kemudian bakar sampai ose membara Bila menggunakan lidi, langsung dibuang ke dalam botol berisi disinfektan.

.Lakukan fiksasi. Gunakan pinset atau penjepit kayu untuk memegang kaca . Pastikan apusan menghadap ke atas Lewatkan 3 x melalui api dari lampu spiritus. Pemanasan yang berlebihan akan merusak hasil.

PEWARNAAN METODE ZIEHL NEELSEN

1 2

Letakkan sediaan dengan bagian apusan menghadap ke atas pada rak yang ditempatkan di atas bak cuci atau baskom, antara satu sediaan dengan sediaan lainnya masing-masingberjarak kurang lebih 1 jari.

Genangi seluruh permukaan sediaan dengan carbol fuchsin. Saring zat warna setiap kali akan melakukan pewarnaan sediaan.
4

Panasi dari bawah dengan menggunakan sulut api setiap sediaan sampai keluar uap, jangan sampai mendidih
5

Dinginkan selama minimal 5 menit.

Bilas sediaan dengan air mengalir secara hati-hati dari ujung kaca sediaan

Jangan ada percikan ke sediaan lain

Miringkan sediaan menggunakan penjepit kayu atau pinset untuk membuang air
8

Genangi dengan asam alcohol sampai tidak tampak warna merah carbol fuchsin. Jangan sampai ada percikan ke sediaan lain

Genangi permukaan sediaan dengan methylene blue selama 20-30 detik

Bilas sediaan dengan air mengalir. Jangan ada percikan ke sediaan lain

10

11

Miringkan sediaan untuk mengalirkan sisa methylene blue

Keringkan sediaan pada rak pengering. Jangan keringkan dengan kertas tissue

Pewarnaan BTA menurut Tan Thiam Hok-Devulder 1. Buat sediaan, fiksasi seperti biasa 2. Genangi dengan larutan Kinyoun selama...................................................... 3 menit 3. Cuci dengan air selama.................................................................................. menit 4. Genangi dengan Larutan Gabbet..................................................................1-3 menit 5. Cuci dengan air dan kemudian dikeringkan

Larutan Kinyoun terdiri dari : Basic fuchsin....................... 4 gr Fenol................................... 8 cc Alkohol 95%....................... 20 cc Aquadest............................ 100cc

Larutan Gabbet terdiri dari : Biru metilin.............................. 1 gr H2SO4 96%............................ 20 cc Alkohol absolut....................... 30 cc Aquadest .................................50 cc

C. PEWARNAAN KHUSUS Tidak semua bakteri atau bagian-bagiannya dapat diamati dengan baik dengan pewarnaan sederhana atau pewarnaan gram. Untuk dapat mempelajari morfologi atau mengamati bagianbagian tertentu bakteri maka harus dilakukan pewarnaan khusus. I . Pewarnaan spora menurut Schaefer Fulton 1. Buat sediaan dan fiksir pada gelas objek 2. Tuang dengan larutan malachite green 5% 3. Panaskan dibawah nyala api ( jangan mendidih ) selama 5 menit 4. Cuci dengan air 5. Genangi dengan safranin atau air fuchsin 0.05%... selama 30 detik 6. Cuci dengan air kran dan keringkan

II. Pewarnaan Kapsul menurut Gins-Burri ( modified) 1. Sediakan satu tetes suspensi bakteri yang akan diamati pada salah satu ujung gelas objek. Kemudian pada kiri dan kanannya diteteskan pula satu tetes tinta India dan satu tetes larutan glukosa 6%. 2. Campurkan ketiga tetesan tadi dengan ujung gelas objek tadi yang bersih dan dengan bantuan gelas objek tersebut dibuat sediaan hapus (seperti membuat sediaan hapus darah). 3. Keringkan sediaan hapus tersebut dan fiksir dengan cara menggenanginya dengan metilalkohol lalu keringkan hati-hati diatas nyala api. 4. Genangi dengan larutan kristal violet selama 1-2 menit. 5. Cuci dengan air, lalu keringkan.

III. Pewarnaan Flagella Dikenal beberapa cara untuk pewarnaan flagella yaitu pewarnaan menurut Gray, menurut Leifson atau modifikasi Leifson. Agar hasil pewarnaan baik, digunakan kultur berusia 12-24 jam. 1. Buat suspensi bakteri dalam aquadest ( jangan NaCl) dari koloni hingga membentuk campuran yang tidak terlalu tebal ( cloudy). 2. Campurkan satu tetes suspensi diatas dengan satu tetes aquadest pada gelas objek yang bebas lemak. Gelas objek harus dibersihkan dengabn NaOH KOH agar lemak dapat dihilangkan dan cuci dengan asam chlorida encer lalu bilas dengan aquadest. 3. Letakkan satu tetes kultur yang akan diperiksa itu diatas objek gelas dan buatlah sediaan hapus yang tipis lalu keringkan dengan nyala api. Hati-hati sebab pemanasan dapat menghancurkan flagella. Digunakan mordant dari Gray dan Carbofuchsin sebagai zat warnanya.

Cara Gray 1. Sediaan pada objek gelas digenangi dengan mordant dari uan Gray selama 5-10 menit 2. Cuci dengan aquadest

3. Genangi dengan carbofuchsin selama 5-10 menit 4. Cuci dengan air kran 5. Keringkan dan periksa dibawah mikroskop

IV.Pewarnaan Giemsa Untuk Chlamydia 1. Buat sediaan pada gelas objek yang dikeringkan dalam udara ( jangan dipanaskan) 2. Fiksir sediaan tersebut dengan metanol absolut selama 5 menit 3. Genangi dengan larutan Giemsa yang dibuat baru dan biarkan selama 1 jam 4. Cuci segera dengan ethyl alkohol 95% untuk membuang kelebihan zat warna
5. Keringkan

V. Pewarnaan Gimenez Untuk Chlamydia 1. Buat sediaan hapus yang tipis pada gelas objek dan keringkan dalam udara ( jangan dipanaskan) 2. Genangkan dengan carbol basic fuchsin yang disaring dan biarkan selama 1-2 menit 3. Cuci dengan air kran hingga bersih 4. Genangi dengan malachit green selama 6-9 detik 5. Cuci dengan air kran 6. Keringkan dengan bantuan kertas hisap Hasil : elementary bodies berwarna merah dan warna dasar kehijauan

VI. Pewarnaan Truant Auramine-Rhodamine Merupakan tekhnik pewarnaan mycobacteria memakai tekhnik fluorescent, jadi hasil pewarnaan diamati dengan mikroskop fluorscent. Zat warna yang digunakan yaitu : a. Zat warna fluorescent Auramine O ( C.I.41000)...... Rhodamine B ( C.I.749)...... Glycerol................................ Phenol.................................. Aquadest............................. 1,50 g 0,75g 75.00 ml 10.00ml 50.00ml

b. Decoloriser: 0.5% HCl dalam 70%ethyl alkohol

c. Counter stain : potassium permanganas 0.5% dalam air

Teknik pewarnaan : 1. Buat sediaan hapus dan fiksir dengan dipanaskan 2. Genangi dengan zat warna fluorescent selama 15 menit, suhu 370C 3. Cuci dengan aquadest 4. Lunturkan dengan decoloriser selama 2-3 menit 5. Cuci dengan aquadest 6. Genangi dengan counterstain selama 2-4 menit 7. Cuci dengan air dan keringkan

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan coccus Gram positif ( Staphylococcus sp) 2. Biakan batang Gram negatif ( Escherichia coli) 3. Biakan batang Gram positif ( Bacillus subtilis )

YANG DIKERJAKAN : 1. Pewarnaan sederhana terhadap biakan diatas 2. Pewarnaan Gram terhadap biakan diatas 3. Amati hasil pewarnaan. 4. Buat laporan praktikum. Laporkan bentuk koloni pada biakan diatas dan gambarkan bentuk bakteri yang terlihat di bawah mikroskop.

PERTANYAAN : 1. Apa yang dimaksud dengan Muchs granule ?

2. Bila dan dalam keadaan apaa bakteri gram (+) menjadi gram (-) ? 3. Apa yang dimaksud dengan pewarnaan differensial ?

KEPUSTAKAAN 1. Ballows A, Hausler WJ. Diagnostic Procedurs for Bacterial, Mycotic and Parasitic Infection.6th ed. Amer Public Health Assoc. Inc. Washington DC: 808-810, 1981 2. Frankel s, reitman S and Sonnenwith,AC: Grad wohls Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. 7 th ed. The Mosby .Co.Saint Louis 2: 1068-76,1970 3. Iswara R. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran, 9-13, 1987 4. Lennete EH, Balows A, Hausler WJ and Truant JP: Manual of Clinical Microbiology. 3th ed. Amer Society for Microbiol. Washington DC.1011-1024, 1980

Praktikum III PEMBIAKAN, FLORA NORMAL DAN KONTAMINAN Penyusun : Maria Simatupang

I. TUJUAN

PEMBIAKAN

Agar mahasiswa terampil menanam dan melakukan isolasi bakteri pada media perbenihan dari spesimen seperti sputum, pus, darah, cairan serebrospinal dan juga berasal dari air, tanah dan lain-lain. PENDAHULUAN Sebagai makhluk hidup bakteri memerlukan makanan yang sesuai agar dapat berkembang biak. Pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium membutuhkan zat-zat yang diperlukan untuk pertumbuhan sintesis sel, energi atau metabolisme. Pada umumnya media itu terdiri dari ekstrak ragi, pepton dan agar. Untuk media khusus harus diperkaya dengan darah dan zat-zat lain. Menurut konsistensinya media biakan yang digunakan bisa bentuk padat, semi padat dan cair. Pada media padat dapat dilihat bentuk koloni. Pada media semi padat dapat dilihat apakah bakteri mempunyai pergerakan atau tidak. Pada media cair dapat dilihat pertumbuhan dan adanya gas. Bila menanam secara anaerob permukaan atas dilapisi dengan lilin. Bahan-bahan yang disediakan : 1. Sputum, darah, cairan serebrospinal, air, tanah, dll. 2. Beberapa spesies bakteri pada medium cair Staphylococcus sp. dan E. coli., Proteus sp. 3. Media lempeng agar nutrient, agar miring, medium cair dan medium cair dengan tabung durham terbalik. 4. Sengkelit/ose ujung lurus dan ujung bulat. : Staphylococus sp., campuran

5. Lampu spiritus atau lampu Bunsen. 6. Kapas lidi steril. Cara kerja : Ose yang digunakan untuk menanam bakteri sebelum dan sesudahnya harus dipanaskan hingga pijar (merah) di atas nyala api supaya ose tersebut steril dan dinginkan dahulu sebelum digunakan menanam bakteri. Bukalah tutup cawan petri secukupnya saja untuk menghindari kontaminasi dari udara. Bila spesies bakteri akan diambil dari medium semi padat atau cair, tutup kapas dari tabung yang berisi media harus dibuka di dekat nyala api dan sebelum menutupnya kembali maka terlebih dahulu ujung tabung dipanaskan. Dengan ose atau kapas lidi steril bakteri diambil dan kemudian dilakukan penanaman pada lempeng agar atau pada medium cair. Ose ujung lurus dipakai untuk menanam pada agar semi padat. Media yang telah siap ditanam dengan bakteri lalu dieramkan dalam inkubator dengan temperatur yang sesuai (temperatur optimum 37C). Bila menginginkan suasana anaerob maka lempeng agar dimasukkan ke dalam anaerobic jar. Ada indikator yang akan menunjukkan apakah suasana sudah anaerob atau belum. Candle jar diperlukan untuk menciptakan suasana mikroaerophilik. Biasanya setelah 18-24 jam telah dapat dilihat pertumbuhan bakteri yaitu terbentuknya koloni bakteri pada permukaan media atau terjadi kekeruhan pada media cair. Kadangkadang dibutuhkan waktu penanaman yang lebih lama lagi tergantung bakteri yang ditanam.

YANG AKAN DIKERJAKAN : 1. Penanaman pada permukaan lempeng agar 2. Penanaman pada media semi padat. 3. Penanaman pada media cair. 4. Buatlah laporan pekerjaan dan pengamatan tersebut.

1.

Penanaman pada permukaan medium padat. Ose atau kapas lidi digunakan untuk mengambil bakteri dari bahan pemeriksaan atau dari koloni pada medium cair yang mengandung kultur bakteri. Lalu ose atau kapas lidi itu dipakai untuk menyemai bakteri tersebut pada permukaan medium padat dengan cara goresan (menstreak) secara berulang-ulang seperti gambar di bawah ini (goresan di kwadran).

Di samping teknik goresan di atas ada lagi dikenal goresan radian dan goresan sinambung. Penyentuhan tersebut dilakukan berulang-ulang sedemikian sehingga dapat diperoleh koloni yang terpisah pada proses penyentuhan terakhir yaitu : a. Pada proses penyentuhan pertama kali bakteri disemai masih rapat satu sama lainnya b. Pada penyentuhan ke-2 bakteri semai semakin renggang c. Pada penyentuhan ke -3 bakteri yang disemai semakin renggang lagi d. Dan pada penyentuhan terakhir penyemaian bakteri sudah sedemikian renggang sehingga diharapkan bakteri dapat tumbuh dengan membentuk koloni terpisah (isolated colony) Cara lain untuk mendapatkan koloni yang terpisah ialah dengan teknik : Agar tuang Agar sebar

2. Penanaman pada agar padat miring Penanaman pada agar miring ialah dengan cara memasukkan ose dan menanam pada permukaan agar miring tersebut seperti pada penanaman agar miring TSI (Triple Sugar Iron). Disini digunakan ose steril berujung lurus, lalu ditusukkan tegak lurus ke dalam kira-kira 1-1 cm dari dasar tabung (butt). 3. Penanaman pada medium semi padat (semi solid) Dengan ose ujung lurus yang steril diambil dari koloni yang terpisah. Tusukkan ose tersebut tegak lurus ke dalam media semi padat kira-kira 1-1 cm dari dasar. 4. Penanaman pada medium cair Bakteri diambil dari sediaan menggunakan ose atau kapas lidi steril dan lalu dimasukkan ke dalam medium cair dan digoyang-goyangkan dalam medium cair tersebut agar bakteri terlepas dari ose atau kapas lidi steril. Medium cair ada yang diisi dengan tabung terbalik (tabung Durham) yaitu untuk melihat apa ada pembentukan gas atau tidak.

II.

FLORA NORMAL

TUJUAN : Mengetahui flora normal yang terdapat pada bagian dari tubuh, misalnya yang terdapat pada rongga mulut, saluran pencernaan, vagina, konjungtiva, kulit dan kuku jari tangan. PENDAHULUAN Kulit dan selaput lendir manusia didiami oleh bermacam-macam mikroorganisme atau flora yang dapat dibagi atas 2 kelompok flora yaitu : 1. Resident flora yaitu mikroorganisme tertentu yang hidup menetap dan selalu dijumpai pada bagian tubuh tertentu dan pada usia tertentu. 2. Transient flora yaitu mikroorganisme yang patogen atau non patogen yang menempati kulit atau selaput lendir hanya untuk sementara (beberapa jam, beberapa hari atau

beberapa minggu). Mikroorganisme ini berasal dari sekitar tubuh kita, tidak menimbulkan penyakit dan tidak menetap pada tempat tersebut.

YANG DIPERIKSA : A. Sediaan dari kotoran kuku, gigi dan usapan tenggorok. B. Agar darah atau agar nutrien yang telah berisi kultur dari kotoran kuku, rambut, gigi atau kultur dari usapan tenggorok.

YANG DIKERJAKAN : 1. Penanaman pada agar nutrien plate (plate dibagi 4 sektor, lalu tanam dengan kotoran gigi, sehelai rambut, usapan tenggorok dan kotoran kuku, lalu eramkan dalam inkubator 37c selama 24 jam, lihat hasilnya keesokan harinya. 2. Buatlah pewarnaan gram dari sediaan A dan sediaan B. 3. Lakukan pengamatan mikroskopis dari pewarnaan tersebut di atas. 4. Laporkan hasil pengamatan anda.

III.

KONTAMINAN

TUJUAN : Menunjukkan kepada mahasiswa agar mahasiswa mengetahui banyaknya kontaminan yang ada baik di udara, lantai, dinding dan tempat lainnya. PENDAHULUAN Telah diketahui bahwa bakteri maupun mikroorganisme lainnya menempati sebagian besar dari alam ini. Spesimen atau bahan pemeriksaan yang berasal dari pasien mudah dicemari oleh mikroorganisme tersebut. Jamur nonpatogen dapat tumbuh pada media yang kita tanam. Nanah (pus) yang berasal dari luka terbuka pada kulit, sputum atau bahan pemeriksaan lain kalau pengambilannya atau transportasinya tidak baik, dapat tercemar dan mengganggu kita menentukan kuman penyebab infeksi.

Untuk dapat membedakan apakah mikroorganisme yang tumbuh pada suatu kultur adalah kuman penyebab infeksi atau hanya kontaminan yang mencemari bahan pemeriksaan, maka kita harus mempelajari kontaminan-kontaminan itu agar tidak salah menentukannya sebagai kuman penyebab infeksi. Beberapa jamur di bawah ini merupakan kontaminan, antara lain : Penicillium sp Aspergillus sp Mucor sp Cephalosporium sp Monilia sitophila sp Rhizopus sp

Beberapa bakteri yang merupakan kontaminan : Bacillus subtilis Proteus sp

BAHAN PRAKTIKUM : Dua lempeng agar darah Kapas lidi

YANG DIKERJAKAN : 1. Biarkan lempeng agar darah terbuka selama 30 menit dan tutup kembali 2. Lempeng agar darah lainnya dibagi atas 4 sektor dan biakkan sampel dari keempat sudut lantai ruang praktikum yang diambil dengan kapas steril. 3. Kedua lempeng agar darah tersebut dimasukkan ke dalam inkubator 37c selama 24 jam 4. Perhatikan koloni yang tumbuh pada lempeng agar darah tersebut setelah pengeraman itu dan dilakukan pewarnaan. 5. Amati hasil pewarnaan di bawah mikroskop dan dibuat laporan.

KEPUSTAKAAN : 1. Iswara R, Penuntun Praktikum Mikrobiologi FK USU, dikeluarkan oleh Bagian Mikrobiologi FK USU, Medan, 1976. 2. Lay, Bibiana W., Analisa Mikroba di Laboratorium, Edisi I, Cetakan I, Jakarta, PT. Raja Grafindo Persada, p. 40-41, 1994. 3. Mackie, TJ. Cartney, Handbook of Practical Bacteriology 9th ed, Livingstone Ltd, p.1314. 4. Timbury, Morag. C, et al, Medical Bacteriology 3rd edition, Churchil Livingstone, p.152153, 1990.

Praktikum ke IV COCCUS PENYEBAB INFEKSI BERNANAH (PYOGENIC COCCI) Penyusun : Sri Amelia

Tujuan : Menunjukan cara-cara pengenalan genus dan species : Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus dan Neisseria berdasarkan sifat-sifatnya. Bahan Pemeriksaan : Bergantung dari lokasi infeksi, misalnya : usap tenggorok, nanah, darah, air kemih, tinja, cairan serebrospinalis, cairan pleura, dan dahak. Khusus untuk Neisseria, bahan pemeriksaan adalah sekret dari : uretra, prostat, endocervix, anorectal, oropharynx, kelenjar Bartholini, bisa juga dari cairan sendi dan darah, jika ada tanda-tanda infeksi sistemik.

STAPHYLOCOCCUS PENDAHULUAN Infeksi oleh mikroorganisme ini terutama menimbulkan penyakit pada manusia. Setiap jaringan ataupun organ tubuh dapat diinfeksi olehnya dan menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas, yaitu peradangan, nekrosis, dan pembentukan abses. Infeksinya dapat berupa furunkel yang ringan pada kulit sampai berupa suatu piema yang fatal. Kecuali impetigo umumnya kuman ini menimbulkan penyakit yang bersifat sporadik bukan epidemik.
Staphylococcus adalah bakteri berbentuk sferis, termasuk dalam famili Micrococcaceae. Genus Staphylococcus terdiri dari sekurangnya 30 spesies, dan terdapat tiga spesies yang penting secara klinik antara lain Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis (Staphylococcus albus) dan Staphylococcus saprophyticus (Staphylococcus citreus).

Pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan Gram menunjukkan bahwa Staphylococcus sp. adalah mikroorganisme berbentuk bola (kokus), Gram positif, biasanya tersusun dalam kelompok-kelompok tidak teratur bergerombol seperti buah anggur (staphyle = a brunch of grapes). Berdasarkan atas pembentukan pigmen-pigmen yang berbeda, dikenal 3 macam Staphylococcus sp. pada media padat : 1. Staphylococcus aureus : koloni berwarna kuning emas. 2. Staphylococcus citreus : koloni berwarna kuning citrun. 3. Staphylococcus albus : koloni berwarna putih. Morfologi Morfologi sel : Berbentuk bola (kokus) Susunan seperti buah anggur (berkelompok) Gram positif (pada pewarnaan Gram)

Morfologi koloni : Koloni cembung Berwarna sesuai pigmen yang terbentuk ( kuning emas, kuning citrun, putih) Pada agar darah dapat terlihat adanya hemolisa atau tidak Pada isolasi Staphylococcus aureus akan menghasilkan pigmen berwarna kuning emas (golden-yellow). Koloni yang putih atau pucat bisa juga dijumpai pada subkultur. Koloni Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus saphrophyticus biasanya putih tapi kadang bisa juga kuning pucat. Pada lempeng agar darah, tampak daerah jernih (clear zone) di sekitar koloni Staphylococcus aureus, hal ini dikarenakan bakteri ini menghasilkan hemolisin. Semua spesies Staphylococcus dapat tumbuh pada lempeng Mannitol Salt Agar (MSA), tapi hanya Staphylococcus aureus yang dapat memfermentasi mannitol menjadi asam, sehingga terjadi perubahan pH media dan terlihat media di sekitar koloni itu berwarna kuning karena MSA mengandung indikator phenol red.

Diantara ketiga spesies Staphylococcus tersebut, Staphylococcus aureus adalah yang paling patogen pada manusia. Staphylococcus epidermidis bisa juga menimbulkan penyakit yang serius pada penderita immunocompromissed. Sedangkan Staphylococcus saphrophyticus dapat menyebabkan infeksi saluran kemih. Perbedaan ketiga spesies tersebut dapat dilihat pada tabel I. Genus Staphylococcus menghasilkan enzim katalase yang kuat. Tes katalase dapat membedakan koloni Staphylococcus sp. (katalase positif) dari koloni Streptococcus sp. (katalase negatif). Tabel I : Karakteristik Spesies Staphylococcus
No Organisme Fermentasi Mannitol 1. 2. 3. Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus + + + S S R Beta Beta / O O Koagulase DNAse Novobiocin Hemolisa

IDENTIFIKASI Staphylococcus sp. berdasarkan : 1. Melihat morfologi koloni, pigmentasi, dan hemolisa pada agar darah. 2. Melihat morfologi bakteri secara mikroskopis dari sediaan usap yang diwarnai dengan pewarnaan Gram. 3. Tes katalase. 4. Tes koagulase. 5. Tes DNA-ase. 6. Melihat fermentasi terhadap mannitol. 7. Tes novobiosin. Tes Katalase 1. Teteskan satu tetes hidrogen peroksida (H2O2) di atas kaca slide yang bersih. 2. Sterilkan ose/sengkelit. 3. Ambil koloni bakteri yang akan diuji. 4. Campurkan koloni yang diambil ke dalam hidrogen peroksida.

5. Interpretasi : Bila terbentuk gelembung udara tes katalase positif. Bila tidak terbentuk gelembung udara tes katalase negatif.

Tes Koagulase Terdapat dua cara untuk melakukan tes koagulase yaitu Slide Tes dan Tube Tes. A. Slide Tes : 1. Teteskan satu tetes aquadest diatas kaca slide yang bersih. 2. Emulsikan koloni bakteri Staphylococcus sp. pada tetesan aquadest itu. 3. Tambahkan satu sengkelit plasma manusia. 4. Campuran tersebut diaduk menggunakan batang pengaduk. 5. Interpretasi Perhatikan adanya gumpalan. Bila terbentuk gumpalan slide tes (+) : Staphylococcus aureus. Bila gumpalan tidak terbentuk slide tes (-) : lanjutkan dengan Tube Tes.

B. Tube Tes : 1. Inokulasi 0,5 ml citrated rabbit plasma (yang telah diencerkan 1 : 4) dengan 1-2 tetes biakan Staphylococcus sp. yang telah dieramkan satu malam. 2. Eramkan 35C dalam water-bath. 3. Jika terjadi koagulasi sempurna ataupun sebagian (parsial) sesudah pengeraman 1-4 jam, maka tes dikatakan positif. Kontrol : 1. Kontrol positif : Staphylococcus aureus ATCC 25923. 2. Kontrol negatif : Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis masing- masing pada Agar Darah dan MSA. 2. Hidrogen peroksida (H2O2).

3. Aquadest. 4. Plasma manusia.

YANG DIKERJAKAN : 1. Perhatikan koloni biakan Staphylococcus sp. masing-masing pada lempeng Agar Darah dan lempeng MSA (Mannitol Salt Agar). 2. Lakukan pewarnaan Gram untuk melihat morfologi Staphylococcus sp. secara mikroskopis. 3. Lakukan tes katalase dan tes koagulase. 4. Membuat laporan praktikum.

STREPTOCOCCUS PENDAHULUAN Pada pemeriksaan mikroskopis dari sediaan usap yang diwarnai dengan pewarnaan Gram, Streptococcus sp. akan terlihat berbentuk bola (kokus), Gram positif, tersusun seperti rantai. Koloninya pada agar darah biasanya tidak berpigmen. Berdasarkan tipe hemolisanya pada agar darah, maka Streptococcus sp. dapat dibagi atas: 1. Streptococcus alpha hemolyticus. 2. Streptococcus beta hemolyticus. 3. Streptococcus anhemolyticus (gamma hemolyticus). Streptococcus alpha hemolyticus disebut juga Streptococcus viridans. Pada agar darah Streptoococcus ini akan memperlihatkan hemolisa yang tidak sempurna, dimana akan tampak warna kehijau-hijauan di sekeliling koloni (green hemolysis). Streptococcus beta hemolyticus, pada agar darah akan menimbulkan hemolisa yang sempurna, dimana akan terlihat zona bersih di sekeliling koloni (clear zone). Dengan tes presipitin, Lancefield membagi Streptococcus beta hemolyticus atas beberapa sero group. Serogroup A (SBHA/Streptococcus beta hemolyticus group A) disebut juga Streptococcus pyogenes merupakan kelompok yang paling patogen pada manusia. Infeksi oleh

SBHA ini dapat menimbulkan sequelae non-supurative yaitu demam rematik dan glomerulonefritis akut. Diagnosa SBHA dapat ditegakkan berdasarkan kepekaannya terhadap basitrasin. Lebih dari 95% SBHA peka/sensitif terhadap basitrasin. Serogroup B disebut juga Streptococcus agalactie, merupakan flora normal pada saluran kelamin wanita dan merupakan penyebab penting pada sepsis dan meningitis neonatal. Bakteri ini jarang peka terhadap basitrasin, dan memberikan respon positif terhadap tes CAMP. Serogroup C dan G, kadang-kadang terdapat pada farings. Kelompok ini dapat menyebabkan sinusitis, bakteremia dan endokarditis. Serogroup D, termasuk Enterococcus (Streptococcus fecalis, Streptococcus faecium) dan non-enterococcus (Streptococcus bovis, Streptococcus equinus). Serogroup E, F, H, dan K-U jarang menimbulkan penyakit pada manusia. Streptococcus anhemolyticus, pada agar darah tidak menunjukkan hemolisa. Morfologi Bakteri Secara Mikroskopis : Bakteri berbentuk bulat (kokus). Susunannya seperti rantai panjang/pendek. Tidak memiliki spora. Gram positif, kecuali pada kultur tua Gram negatif.

IDENTIFIKASI Streptococcus sp. : 1. Morfologi koloni, hemolisa pada Agar Darah. 2. Morfologi bakteri secara mikroskopis dari sediaan usap yang diwarnai dengan Gram. 3. Uji kepekaan terhadap basitrasin (bacitracin susceptibility test). Tes Basitrasin : 1. Dengan sengkelit steril, lakukan subkultur dari koloni yang diperiksa ke lempeng agar darah . 2. Dengan forceps steril letakkan disk basitrasin (0,04 U) di perpotongan goresan pertama dengan goresan kedua. 3. Eramkan dalam inkubator pada suhu 37C selama 18-24 jam.

4. Adanya zona hambatan di sekeliling disk menunjukkan tes positif (peka terhadap basitrasin). YANG DIKERJAKAN : 1. Perhatikan biakan pada lempeng agar darah : o Streptococcus alpha-hemolyticus o Streptococcus beta-hemolyticus o Streptococcus anhemolyticus 2. Lakukan pewarnaan Gram. 3. Perhatikan morfologi bakteri Streptococcus sp. di bawah mikroskop. 4. Lakukan tes katalase. 5. Lakukan tes basitrasin. 6. Buat laporan praktikum. DIPLOCOCCUS PNEUMONIAE = Streptococcus pneumoniae/Pneumococcus PENDAHULUAN Infeksi bakteri ini pada manusia yang khas adalah akan menyebabkan penyakit pneumonia lobaris. Selain itu dapat menimbulkan sinusitis, otitis media, osteomielitis, artritis, peritonitis, ulserasi kornea dan meningitis. Dari pneumonia lobaris dapat terjadi komplikasi berupa septikemia, empiema, endokarditis, perikarditis, meningitis dan artritis. Pada pemeriksaan mikroskopis dari sediaan usap yang diwarnai dengan Gram, Diplococcus pneumoniae akan tampak berbentuk lanset, berdua-dua, Gram positif dan mempunyai kapsul. Mikroorganisme ini sukar tumbuh pada medium sederhana, mudah larut dalam larutan garam empedu dan sensitif terhadap optochin (ethyl-hydrocuprein). Koloni D.pneumoniae di lempeng agar darah sukar dibedakan dengan Streptococcus viridans, karena keduanya memberikan hemolisa yang tidak sempurna (alpha-hemolisa). Perbedaan Diplococcus pneumoniae dan Streptococcus viridans dapat dilihat pada tabel II.

Tabel II. Perbedaan antara Diplococcus pneumoniae dan Streptococcus viridans

Perbedaan 1. 2. Morfologi koloni Morfologi mikroskopis Diplococcus pneumoniae Hemolisis, draughtman koloni Oval lanset Dua-dua, ranta pendek 3. 4. 5. 6. Optochin disk Bile solubility Kapsul Virulensi terhadap manusia Peka/sensitif Larut Berkapsul Tinggi Streptococcus viridians Hemolisis, koloni convex Spheris ovoid Berantai panjang Tidak peka/resisten Tidak larut Tidak ada kapsul Sangat rendah

IDENTIFIKASI : 1. Morfologi koloni hemolisa 2. Morfologi sel mikroskopik dari sediaan usap yang diwarnai dengan Gram 3. Reaksi Quellung 4. Tes optochin 5. Bile solubility test Reaksi Quellung cepat dan spesifik untuk diagnosa D.pneumoniae. Prinsip : Reaksi pengendapan (presipitasi) antara kapsul dan antiserum. Caranya : Sputum segar yang diemulsi dicampur dengan antiserum akan menyebabkan pembengkakan kapsul untuk identifikasi D.pneumoniae. Eksudat peritoneal juga dapat digunakan sebagai bahan untuk tes pembengkakan kapsul. Tes Optochin Prinsip : Pertumbuhan D.pneumoniae dihambat oleh optochin (ethylhydrocuprein) sedangkan Streptococcus viridans tidak. Prosedur : 1. Inokulasi lempeng agar darah dengan koloni yang sedang diperiksa ( yang diduga D.pneumoniae).

2. Letakkan optochin disk (5 g) di perpotongan streak pertama dengan streak kedua. 3. Eramkan dalam inkubator dengan atmosfir 5-10% (candle jar) 37C selama 18-24 jam. 4. Perhatikan zona hambatan di sekeliling disk. 5. Interpretasi hasil : Positif Negatif Ragu-ragu : diameter zona hambatan 15 mm : diameter zona hambatan 6 mm : diameter zona hambatan 7-14

Bile Solubility Test : 1. Sediakan larutan 2% sodium, desoxychyolate pH 8,2 2. Ambil satu sengkelit larutan diatas, kemudian sentuhkan yang diduga koloni D.pneumoniae. 3. Eramkan 35C - 37C selama 15 menit 4. Interpretasi hasil : D.pneumoniae Strept. viridans : koloni melarut : koloni tidak larut

BAHAN PRAKTIKUM : a. Biakan D.pneumoniae dan Strept. viridans di lempeng agar darah. b. Hasil uji kepekaan terhadap optochin (tes optochin) untuk membedakan D.pneumoniae dan Strept. viridans. YANG DIKERJAKAN : 1. Perhatikan biakan pada lempeng agar darah : o D.pneumoniae o Strept. viridans 2. Lakukan pewarnaan Gram. 3. Perhatikan morfologi sel bakteri dari biakan diatas di bawah mikroskop. 4. Menilai hasil uji kepekaan menggunakan optochin disk (tes optochin). 5. Buat laporan praktikum.

NEISSERIA PENDAHULUAN Neisseria adalah sekelompok coccus Gram negatif yang biasanya berpasangan. Ada spesies Neisseria yang hidup sebagai flora normal di selaput lendir saluran pernapasan manusia dan ada yang patogen. Spesies yang patogen yaitu : Neisseria meningitidis (Meningococcus) dan Neisseria gonorrhoeae (Gonococcus). Perbedaan antara N.gonorhoeae dan N.meningitidis biasanya didasarkan atas hasil fermentasi gula-gula N.meningitidis membentuk asam dari glukosa dan maltosa, sedangkan N.gonorrhoeae hanya membentuk asam dari glukosa saja. Hasil tes gula-gula ini dapat dikacaukan oleh sifat pertumbuhan kuman-kuman ini sendiri. Misalnya pembentukan asam dari karbohidrat dapat dikacaukan oleh produk yang bersifat alkali dari degradasi peptone secara ensimatik. Oleh karena itu perlu dilakukan cara identifikasi tambahan. Spesies yang patogen ini bisa dijumpai intraseluler maupun ekstraseluler. Sedangkan spesies yang non-patogen hidupnya ekstraseluler. Semua spesies Neisseria menghasilkan indophenol-oxidase, oleh karena itu memberikan tes oksidase positif dengan reagensia tetrametyl para phnylenediamine dichloride atau N.N-dimethyl-paraphenylene diamine monochloride. Neisseria yang patogen tidak dapat hidup pada media biasa akan tetapi kultur primernya harus pada Coklat Agar atau pada media Thayer Martin yang berisi suplemen dan inhibitor. Untuk dapat tumbuh harus dikultur pada suasana mikroaerofilik, yaitu dalam candle jar pada suhu 36,5 - 37C selama 24 48 jam. IDENTIFIKASI : 1. Pemeriksaan mikroskopis sediaan usap langsung setelah diwarnai dengan pewarnaan Gram, akan terlihat morfologi sel berupa : Susunannya dua-dua (diplococcus) Bentuk seperti biji kopi Gram negatif Ukuran diameter 0,8 Terdapat pada intraseluler dan ekstraseluler

2. Kultur Bahan pemeriksaan harus segera ditanam pada media Coklat Agar atau media Thayer Martin, dieramkan dalam suasana mikroaerofilik (CO2 5-10%) pada suhu 36,5 - 37C selama 24 48 jam. Koloni yang tumbuh berbentuk bulat jernih sampai abu-abu seperti titik-titik embun. 3. Diagnosa sementara (presumptive) ditegakkan dengan tes oksidase positif terhadap yang diduga koloni Neisseria. 4. Diagnosa definitif dilakukan dengan melakukan reaksi fermentasi karbohidrat membentuk asam. Reaksi fermentasi dilakukan pada medium Cystine Trypticase Agar (CTA) yang mengandung 1% karbohidrat. Eramkan pada suhu 37C selama 24 48 jam. Perhatikan tabel di bawah ini : Reaksi Fermentasi Spesies Neisseria
Spesies Neisseria Pembentukan Asam dari Karbohidrat Dextrosa N. meningitides N. gonorrhoeae N. catarrhalis N. sicca N. flavescens + + + Maltosa + + Sukrosa + + + + + +
+

Tumbuh di Nutrien Agar

Tumbuh pada suhu 22C

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan Neisseria pada Agar Coklat atau Thayer Martin. 2. Reagensia tes oksidase. 3. Pewarnaan Gram. YANG DIKERJAKAN : 1. Melihat secara makroskopis morfologi koloni Neisseria sp. 2. Melakukan pewarnaan Gram 3. Melihat secara mikroskopis bentuk sel bakteri Neisseria sp. 4. Melakukan tes oksidase.

5. Buat laporan praktikum.

KEPUSTAKAAN 1. Forbes , BA., Sahm, DF., Weissfeld, AS., Diagnostic Microbiology : Bailey & Scotts, 12th edition, Mosby, Missouri, 2007. 2. Brooks, G.F., Butel, J.S., Ornston, L.N., Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A. Jawetz, Melnick & Adelbergs Medical Microbiology, 20th edition, Prentice-Hall International Inc, USA, 2004. 3. Sitti Zuleiha, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran, Departemen Mikrobiologi FK USU Medan, 2005. 4. Levinson, W., Jawetz E., Medical microbiology & immunology : examination & board review, International Edition, 7th edition, McGraw-Hill, USA, 2003. 5. Murray R.P , Rosenthal, K.S., Kobayashi G.S., Pealler M.A.,Medical microbiology , 4th edition, Mosby, Missouri, 2002. 6. Josodiwondo S., Kokus Negatif Gram, Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Fakultas Kedokteran UI, Jakarta, Edisi Revisi, 1994. 7. Warsa UC, Kokus Positif Gram, Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta, Edisi Revisi, 1994.

Praktikum ke V ENTEROBACTERIACEAE Penyusun: Evita Mayasari TUJUAN Memahami prosedur beberapa uji primer sederhana untuk identifikasi famili Enterobacteriaceae. PENDAHULUAN Famili Enterobacteriaceae terdiri dari berbagai grup bakteri batang Gram-negatif nonspora yang habitat alamiahnya usus manusia dan hewan. Tumbuh aerob atau anaerob fakultatif. Ada yang motile dan ada yang non-motile. Spesies yang motile memiliki flagela peritrik, berbeda dengan Pseudomonadaceae yang memiliki flagela polar. Beberapa diantaranya seperti E. coli, merupakan bagian dari flora normal, yang lainnya seperti Salmonella spp. dan Shigella spp. adalah patogen bagi manusia (bakteri usus patogen). Beberapa uji sederhana dapat digunakan untuk mengidentifikasi Enterobacteriaceae. Anggota famili Enterobacteriaceae diklasifikasikan sebagai lactose fermenter dan non-lactose fermenter. Kultur pada media diferensial, misalnya agar eosin-methylene blue (EMB), agar McConkey atau agar desoxycholate dapat membedakan koloni yang lactose fermenter

(berwarna) dengan non-lactose fermenter (tak berwarna) dan dapat digunakan untuk identifikasi presumtif cepat (rapid presumptive identification, lihat Tabel 1). Perbedaan tersebut berdasarkan fakta bahwa organisme E. coli menghasilkan asam kuat dari fermentasi gula-gula. Asam

mengubah indikator pH yang terdapat dalam media agar, seperti agar McConkey, menjadi merah gelap sehingga koloni bakteri beserta agar juga berubah warna menjadi merah gelap. Bakteri yang non-lactose fermenter, seperti Shigella spp., tidak menghasilkan asam kuat sehingga warna koloninya tidak berubah.

Tabel 1. Identifikasi presumtif cepat bakteri enterik Gram-negatif Lactose Fermenter (cepat) Escherichia coli: koloninya metallic sheen pada media diferensial; motile; datar; nonviscous Enterobacter aerogenes: koloninya timbul, non-metallic sheen; sering motile; lebih viscous Klebsiella pneumoniae: sangat viscous, mucoid; non-motile Lactose Fermenter (lambat) Edwardsiella, Serratia, Citrobacter, Arizona, Providencia, Erwinia Non-Lactose Fermenter Shigella sp.: non-motile; tidak menghasilkan gas dari dextrose Salmonella sp.: motile; menghasilkan asam dan biasanya gas dari dextrose Proteus sp.: swarming pada agar; urea cepat dihidrolisis (berbau amonia) Pseudomonas sp. : pigmen hijau-biru dan berfluoresensi, larut ke dalam media, berbau manis

IDENTIFIKASI ENTEROBACTERIACEAE

A. Uji Indol Uji Indol dilakukan untuk melihat kemampuan suatu organisme menghasilkan indole dari degradasi asam amino triptofan. Triptofan dihidrolisis oleh triptofanase untuk menghasilkan tiga produk akhir, salah satunya adalah indole. Dengan kata lain dengan uji Indole dapat dideteksi produksi enzim triptofanase. Oleh karena itu pada uji ini digunakan medium yang mengandung Triptofan. Prosedur : Biakan kuman diambil menggunakan ose steril lalu ditanam pada tabung berisi medium cair yang kaya akan triptofan, diinkubasi pada suhu 37
0

C selama 24 jam. Kemudian

tambahkan 3-5 tetes reagensia kovac pada tabung yang mengandung biakan kuman yang berumur 24 jam tersebut. Kocoklah tabung tersebut lalu diamkan beberapa saat. Reaksi yang positif untuk indole ditandai oleh terbentuknya cincin merah pada permukaan biakan.

Reaksi yang terjadi pada uji Indole diantaranya: 1. Tryptophan Indole + Pyruvic acid + amonia cincin berwarna merah

2. Indole + p - dimethyl amino benzaldehide

B. Uji Methyl Red Methyl red adalah indikator pH antara 6,0 (berwarna kuning) hingga 4,4 (merah).

Bakteri yang mampu menghasilkan asam kuat (laktat, asetat, formik) dari glukosa melalui jalur fermentasi asam dapat dideteksi dengan uji methyl red. Sebagian besar Enterobacteriaceae mampu menghasilkan asam selama fase awal inkubasi, namun hanya bakteri yang mampu mempertahankan pH asam dalam jangka waktu lama (inkubasi 48-72 jam) yang dapat dikatakan uji methyl red-nya positif. Prosedur : Bakteri diinokulasikan pada medium MR/VP, kemudian diinkubasi pada suhu 35C selama 48-72 jam. Kemudian teteskan 5 tetes reagensia methyl red ke dalam medium. Bila terlihat warna merah pada media maka hasil dinyatakan positif.

C. Uji Voges-Proskauer Beberapa Enterobacteriaceae, seperti Klebsiella dan Enterobacter, mampu menghasilkan asetoin dari jalur metabolisme glukosa. Asetoin yang dikonversi menjadi diasetil, ditambah reagensia potassium hydroxide 40% dan -naphtol sebagai katalisator, akan menghasilkan kompleks merah. Prosedur : Bakteri diinokulasikan ke medium MR/VP, diinkubasi pada suhu 35C selama 24 jam, kemudian ke dalam medium ditambahkan 0,6 mL -naphtol 5% dan 0,2 mL KOH 40%, dikocok beberapa saat dan didiamkan selama 10-15 menit. Hasil positif bila dihasilkan warna merah pada medium setelah 15 menit ditetesi reagensia.

D. Uji Citrat Uji citrat menggunakan medium padat yang mengandung garam-garam amonium, natrium citrat, biru brom-thimol, dan agar. Citrat dalam medium ini digunakan sebagai sumber energi. Medium ini mengandung indikator pH bromthymol blue dimana pada suasana alkali

akan berwarna biru. Citrat ini diubah menjadi Pyruvic acid dan CO2. CO2 akan diubah menjadi Na2CO3 yang menyebabkan suasana alkalis dan medium menjadi berwarna biru.

Prosedur : Tanamlah kuman yang berasal dari biakan TSI pada agar miring Simmons Citrate. Inkubasi (37
O

C ) selama 24 jam dan periksalah ada / tidaknya pertumbuhan dan terjadinya

perubahan warna medium dari hijau menjadi warna biru tua, yang menunjukkan hasil positif.

E. Uji Urease Enzim urease yang dimiliki oleh bakteri akan menghidrolisis urea menjadi amonia, air, dan karbondioksida. Enzim ini dapat dideteksi dengan menginokulasikan bakteri pada medium yang mengandung urea sebagai sumber karbon, kemudian diinkubasikan pada suhu 35C dan dideteksi adanya amonia melalui perubahan pH pada indikator pH (merah fenol) yang akan menimbulkan warna merah (suasana alkali) dalam waktu 15, 30 atau 60 menit hingga 4 jam.

F. Pergerakan Bakteri ( Motilitas) Dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri enterik yang akan diidentifikasi tersebut dapat aktif bergerak (motile). Biakan bakteri diambil dengan jarum penanam steril (loop)

kemudian ditusukkan tegak lurus ke dalam medium uji motilitas, yaitu media semisolid. Bila motile, maka setelah 24 jam pengeraman pada suhu 37 OC akan terlihat adanya penyebaran pertumbuhan bakteri ke sekitar tempat tusukan, ditandai dengan bekas tusukan yang tidak jelas, yang berarti uji pergerakan bakteri positif. Sebaliknya apabila pertumbuhan bakteri yang terjadi hanya terbatas pada tempat tusukan, ditandai dengan bekas tusukan yang tampak jelas, maka uji motilitas adalah negatif.

G. Uji Triple Sugar Iron (TSI) Uji TSI digunakan untuk membedakan bakteri enterik Gram-negatif yang memiliki kemampuan untuk memetabolisme laktosa dan sukrosa, menghasilkan asam dari fermentasi, memproduksi gas selama proses fermentasi dan menghasilkan H2S, dengan bakteri yang tidak memiliki kemampuan tersebut.

Medium TSI mengandung 3 macam gula : laktosa 1%, sukrosa 1% dan glukosa 0,1%. Jika hanya glukosa yang difermentasi, maka produksi asam hanya pada dasar tabung (butt) dan menghasilkan warna kuning, sedang pada bagian agar miring (slant) akan berwarna merah akibat kurangnya produksi asam. Jika laktosa dan sukrosa difermentasi maka warna kuning akan dijumpai pada butt dan slant. Jika dihasilkan gas pada saat fermentasi maka akan terlihat adanya gelembung gas pada butt atau agar menjadi naik dari dasar tabung. Jika tidak terjadi fermentasi karbohidrat maka medium TSI akan terlihat merah pada butt dan slant-nya. Jika bakteri menghasilkan H2S, maka pada dasar tabung akan terlihat warna hitam (black butt).

H. Fermentasi gula-gula Fermentasi gula-gula dapat digunakan sebagai reaksi tambahan untuk identifikasi famili Enterobacteriaceae. Gula yang dimaksud di sini bisa: glukosa, sukrosa, fruktosa, laktosa, maltosa, manitol, dll. Setelah inkubasi 24 jam, dapat terjadi fermentasi gula-gula positif, ditandai oleh perubahan warna media menjadi kuning. Bila tidak ada perubahan warna media, berarti uji fermentasi gula-gula hasilnya negatif.

BAHAN PRAKTIKUM: 1. Biakan: E. coli, Klebsiella spp. , Proteus spp., Pseudomonas spp., pada agar McConkey dan EMB. 2. Reagensia untuk pewarnaan Gram. 3. Reaksi biokimia beberapa spesies Enterobacteriaceae dalam media uji: IMViC, urease, TSI, seri gula-gula, dan uji motilitas.

YANG DIKERJAKAN: 1. Perhatikan koloni yang tumbuh pada media diferensial, koloni yang berwarna adalah koloni yang non-patogen, koloni yang tidak berwarna kemungkinan besar koloni yang patogen. Buat laporan morfologi dan warna koloni. 2. Lakukan pewarnaan Gram atas koloni yang tumbuh pada media diferensial. Gambarkan morfologi mikroskopik. 3. Perhatikan hasil reaksi biokimia dari uji : IMVIC, Urease, TSI, seri gula-gula, dan uji motilitas. Gambarkan hasil reaksi biokima.

4. Identifikasi spesies bakteri dengan membaca hasil reaksi biokimia. Tuliskan hasil analisis identifikasi.

Tabel 2. Reaksi biokimia beberapa anggota famili Enterobacteriaceae pada uji identifikasi primer Uji Simmons Citrate Voges-Proskauer Produksi Indole Uji TSI Fermentasi

slant/butt

Motilitas

Glukosa

Famili Enterobacteriace ae Enterobacter spp. Escherichia coli Klebsiella spp. Proteus spp. Salmonella spp. Shigella spp. Keterangan:

Methyl Red

al = alkali, a = asam/acid

KEPUSTAKAAN : 1. Dept. Mikrobiologi FK USU. Penuntun Buku Praktikum Mikrobiologi Medik. 2006. FK USU Medan. 2. Brooks, Carroll, Butel, Morse. Jawetz, Melnick, and Adelbergs Medical Microbiology, 24th Ed. 2007. McGraw-Hill.

al/a

-/+

al/a

+/-

al/a

+/-

a/a

+/-

+/-

al/a

a/a

+ + + + +/-

+ +/-

+ + + + + +

+ + + -

+ + + + -

+ + + + +/-

+/-

Sukrosa + + +

Laktosa

Maltosa

Manitol

Urea se

H2 S

Gas

3. Health protection agency. Indole Test. 2010. National Standard Method BSOP TP 19 Issue 2. 4. Winn, Allen, Janda, Koneman, Procop, Schreckenberger, Woods. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 6th Ed. 2006. Lippincott Williams & Wilkins.

Praktikum ke VI BAKTERI BATANG GRAM POSITIF AEROB Penyusun : Tetty Aman Nasution

Batasan terdiri dari : 1. Bakteri batang Gram positif aerob yang membentuk spora, contoh : Bacillus anthracis dan Bacillus subtilis. 2. Bakteri batang Gram positif aerob tang tidak membentuk spora, contoh : Corynebacterium diphteriae. Tujuan : Mempelajari spesies bakteri batang Gram positif aerob berdasarkan : 1. Morfologi makroskopis : pertumbuhan koloni pada media khusus. 2. Morfologi mikroskopis : melalui pewarnaan Gram & pewarnaan khusus (seperti pewarnaan spora). 3. Sifat-sifat biokimia : fermentasi karbohidrat. 4. Tes virulensi in vitro dan in vivo. 5. Tes immunologis.

A. BACILLUS PENDAHULUAN Genus Bacillus termasuk golongan-golongan bakteri batang Gram positif, tersusun seperti rantai yang panjang, tumbuhnya dalam suasana aerob, tidak bergerak dan membentuk spora yang tahan panas. Kebanyakan anggota genus ini adalah saphrofit, tersebar luas di alam, terutama terdapat pada debu-debu, sehingga merupakan kontaminan yang sangat mengganggu kemurnian kultur di laboratorium. Yang tergolong saphrofit diantaranya adalah :

Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacillus mesentericus Bacillus mycoides Bacillus anthracis merupakan anggota dari genus Bacillus yang patogen pada manusia

dan hewan, yang dapat menyebabkan penyakit anthrax. Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan.

BACILLUS ANTHRACIS Bakteri Gram positif batang lurus, ujungnya berbentuk empat segi, tersusun seperti rantai atau satu-satu, tidak bergerak dan hidup dalam suasana aerob. Dalam jaringan, bakteri ini dapat membentuk kapsul dan toksin (strain yang virulen). Pembiakan pada media agar biasa akan memperlihatkan pertumbuhan koloni dengan pinggir berombak-ombak seperti rambut kusut (curled hair). Dalam media gelatin tumbuh khas berupa pohon fir terbalik (inverted fir tree growth) dan pencairan gelatin terjadi secara perlahanlahan dimulai dari puncak. Dalam agar darah terlihat sedikit hemolisa. Secara in vitro, bila media mengandung serum dan ion bikarbonat yang tinggi atau tekanan CO2 yang tinggi akan tumbuh koloni smooth (S koloni) dan adanya pembentukan kapsul. Strain yang sanggup membentuk kapsul belum tentu virulen. Strain dianggap virulen bila mampu membentuk kapsul dan toksin di dalam jaringan tubuh. Bahan Pemeriksaan Bahan-bahan pemeriksaan adalah : 1. Swab dari lesi kulit (cutaneous lessions) 2. Darah 3. Sputum 4. Sediaan jaringan

Pemeriksaan Langsung : Sediaan hapus langsung dibuat dari lesi lokal di kulit atau dari darah, kemudian dilakukan pewarnaan dan dilihat di bawah mikroskop. 1. Pewarnaan Gram Batang besar dengan ujung empat segi Gram positif Ukuran : 5-10 x 1-3 micron Tersusun membentuk rantai pendek terdiri dari 2-3 basil ataupun satu-satu (single) Kadang-kadang dijumpai ujung bakteri bulat, terutama yang berasal dari lesi di kulit Dengan pewarnaan Gram, spora akan terlihat berupa refractile area pada bagian vegetatifnya, tidak lebih besar, terletak di bagian tengah ataupun di bagian subterminal. 2. Pewarnaan Kapsul : Dapat menggunakan larutan toluidine blue 0,1% dalam alkohol Pewarnaan lain yang sering dilakukan : a. Mc Fadyeans polychrome methylene blue b. Giemsa c. Wright 3. Pewarnaan Spora 4. Fluorescent Antibody Test (F-A Test)

KULTUR Hasil pemeriksaan pada pengecatan sudah memberikan sugesti untuk menegakkan diagnosis B.anthracis, namun pembiakan tetap diperlukan. Untuk pemeriksaan sangat tercemar/terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya, maka dapat dipakai medium Pearce & Powells yang mengandung bahan-bahan berupa haemin, lysozime, peptone, dan agar.

Gambaran kultur B. anthracis yang khas untuk diagnostik adalah sebagai berikut : 1. Koloni seperti gambaran rambut kusut 2. Pada lempeng agar darah biri-biri (sheep blood agar) tidak terjadi hemolisa 3. Motilitas (-) 4. Pada medium gelatin koloni berupa inverted fir tree dan terjadi pencairan gelatin secara perlahan-lahan 5. Peka (susceptible) terhadap bakteriophage spesifik (gamma phage) 6. Peka terhadap penisilin 7. In vitro, jika medium mengandung serum atau konsentrasi ion bikarbonat yang tinggi akan membentuk kapsul.

ASCOLI TEST (Ascolis Precipitin Reaction) Prinsip dari Ascoli test adalah ekstrak dari jaringan tubuh yang terkena infeksi B.anthracis akan membentuk cincin precipitat jika dicampur dengan anti serum. Ascoli test ini tidak selalu spesifik hasilnya. Cara mengerjakan Ascoli test : 0.5 ml serum dimasukkan ke dalam suatu tabung reaksi yang sempit. Dengan hati-hati teteskan ke dalam filtrat yang telah disediakan (lihat cara pembuatan filtrat). Jika pada pertemuan kedua cairan tersebut terbentuk cincin presipitasi yang putih dalam waktu 5 menit, maka dikatakan test positif. Cara membuat filtrat dari ekstrak jaringan : Kira-kira 2 gram jaringan dididihkan dengan pelarut NaCl fisiologis sebanyak 5 ml, yang telah mengandung asam asetat (1/1000). Dididihkan selama 5 menit Dinginkan lalu saring dengan kertas saring Filtrat yang diperoleh dapat dipakai untuk test di atas.

Percobaan Binatang : Identifikasi selanjutnya dapat dilakukan dengan percobaan binatang. Marmut atau tikus putih disuntik eksudat dari lesi atau bahan dari biakan murni. Dosis kecil dari kultur murni B.anthracis sudah cukup untuk menimbulkan efek mematikan. Pada pemeriksaan akan dijumpai basil-basil dalam darah (jantung & limpa). BACILLUS CEREUS Bacillus cereus adalah organisme tanah yang sering mengkontaminasi. Bila sejumlah besar nasi dimasak dan dibiarkan, dengan perlahan-lahan spora B.cereus bertunas dan sel vegetatif menghasilkan toksin selama fase log pertumbuhan atau selama sporulasi. B.cereus menyebabkan keracunan makanan dalam 2 bentuk : 1. Jenis muntah (vomiting syndrome) : berhubungan dengan emetic toxin, terdapat pada nasi yang terkontaminasi. 2. Jenis diare (diarrhea) : berhubungan dengan enterotoxin, terdapat pada daging dan saus. Adanya B.cereus dalam tinja penderita tidak cukup untuk menegakkan diagnosa penyakit. Oleh karena B.cereus dapat berada dalam tinja orang normal. Kadar 105 bakteri/gram makanan dianggap potensial bermakna. SPORA Spora merupakan struktur yang sangat tahan, dibentuk sebagai reaksi terhadap kondisi yang kurang menguntungkan dari genus ini : 1. Bacillus 2. Clostridium Pembentukan spora (sporulasi) terjadi jika zat-zat makanan seperti sumber karbon dan nitrogen berkurang. Spora dibentuk di dalam sel dan mengandung : DNA bakteri, sitoplasma dalam jumlah kecil, membran sel, peptidoglikan, air sedikit, dan yang paling penting suatu dinding yang tebal seperti keratin yang sangat membantu ketahanan spora terhadap panas,

dehidrasi, radiasi dan zat-zat kimia. Ketahanan ini kemungkinan diakibatkan oleh dipikolinik acid dan ion calcium chelator yang hanya ditemukan pada spora. Kepentingan medis dari spora ini terletak pada kesulitan dalam mensterilisasi alat-alat yang diduga mengandung spora bakteri ini. Sterilisasi hanya dapat dilakukan dengan autoclave pada suhu 121C biasanya selama 30 menit.

BACILLUS SUBTILIS B.subtilis merupakan spesies Bacillus yang potensial sebagai oportunistik patogen. Infeksi oportunistik yang cukup serius antara lain : septikemia, endokarditis, osteomyelitis, dan bronchopneumonia. Infeksi ini berhubungan dengan penggunaan obat parenteral, luka traumatik, luka bakar, hemodialisa dan pada penderita immunosupresi.

B. CORYNEBACTERIUM Spesies Corynebacterium merupakan bakteri berbentuk batang, Gram positif, aerob, tidak bergerak, tidak berkapsul dan tidak membentuk spora. Ciri khas sel bakteri ini adalah pada salah satu ujung yang berbentuk batang itu terdapat pembengkakan yang tidak teratur, seperti pentungan (club shaped). Di dalam sitoplasma sel bakteri dijumpai granula-granula yang tidak teratur, granula metachromatik yang disebut juga Babes Ernst bodies. Granula ini terlihat dengan jelas setelah dilakukan pewarnaan Neisser atau pewarnaan Albert. Ciri khas lainnya adalah susunannya pleomorf, berkelompok berupa pagar (pallisade) atau berbentuk huruf cina dan bisa pula berbentuk huruf Y, L, V. Kebanyakan spesies bakteri ini adalah flora normal pada saluran pernafasan, saluran kemih, konjungtiva dan pada kulit yang disebut dipthreoid, antara lain : C.pseudodiptheriticum C.xerosis C.pyogenes (C.haemolyticum) C.hofmanii C.ulcerans

Corynebacterium yang patogen pada manusia adalah C.diphteriae karena menghasilkan eksotoksin yang kuat dan menyebabkan penyakit diphteria. Ada 3 tipe C.diphteriae yaitu tipe Gravis, tipe Mitis dan tipe Intermedius. C.diphteriae tumbuh lebih baik pada media yang mengandung serum. Pada media Loeffler koloninya kecil, berwarna putih kelabu, bergranula dan pinggirnya rata. Pada media agar darah Mc Leod yang mengandung K-tellurit koloninya berwarna abu-abu sampai hitam sebab tellurit direduksi secara intraseluler. Perbedaan ketiga tipe C.diphteriae
Perbedaan Agar darah Mc Leod Koloni Dalam kaldu Tipe Gravis Anhemolisa Besar, kelabu, tidak teratur Biakan memanjang Tipe Mitis Hemolisa Kecil, hitam, konvek, halus Tumbuh difus Tipe Intermedius Anhemolisa Kecil, abu-abu Mengendap sedimen granuler sebagai

Glukosa, maltosa, dan dekstrin difermentasi membentuk asam, tetapi tidak memecah sukrosa, laktosa dan mannitol.

PEWARNAAN 1.PEWARNAAN NEISSER 1. Buatlah sediaan dan lakukan fiksasi 2. Campurkan 2 bagian Neisser A dengan 1 bagian Neisser B dan genangi sediaan di atas dengan campuran ini selama 15 detik. 3. Lalu zat warna itu dibuang dan genangi dengan Neisser C selama 15 detik. 4. Keringkan dengan kertas saring (jangan dicuci dengan air). 5. Mikroskopis : Sitoplasma berwarna kuning (dengan Chrysoidine) dan coklat (dengan Brismarck Brown) Babes Ernst Bodies berwarna ungu tua.

Larutan zat warna yang digunakan : Neisser A : Biru metilen Alkohol 95% 0,1 gr 5 cc

Asam asetat(glasial) 5 cc

Neisser B : Kristal violet Alkohol 95% Aquadest 1 gr 10 cc 300 cc

Neisser C : a. Chrysoidin Aquadest b. Bismarck Brown Aquadest 2.PEWARNAAN ALBERT 1. Buatlah sediaan seperti biasa pada gelas objek 2. Tuangkan larutan I (Albert 1) selama 3-5 menit 3. Zat warna dibuang dan dituangi dengan larutan II (Albert II) selama 1 menit 4. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring 5. Mikroskopis : Badan kuman (protoplasma) hijau dan Babes Ernst bodies berwarna biru kehitaman. Larutan zat warna yang digunakan : Larutan I (Albert 1) Toluidine biru 0,15 gr Larutan II (Albert II) Jodium 2 gr 1 gr 300 cc 1 gr 300 cc

Malachite hujau As. Asetat glasial Alkohol 95% Aquadest

0,2 gr 1 cc 1 cc 100 cc

Kalium jodida Aquadest

3 gr 300 cc

TES VIRULENSI : Dapat dilakukan secara invitro atau secara invivo 1. Invitro : Test Elek Kertas saring yang telah dicelupkan dalam antitoksin C.diphteriae diletakkan di dalam lempeng agar. Kuman yang akan diperiksa ditanam menyilang dengan kertas saring tadi dan masukkan ke dalam inkubator 37C selama 24 48 jam. 2. Invivo Dengan menyuntikkan intrakutan suspensi bakteri C.diphteriae (yang berasal dari media Loeffler) sebanyak 0,1 0,2 cc pada hewan percobaan (marmut). Caranya adalah sebagai berikut : Ambillah 2 marmut A dan B (beratnya 250 gr). Suntikkan pada A intraperitoneum 500 satuan antitoksin diphteri (ADS). Sedangkan marmut B disuntik sebanyak 30 -50 satuan ADS, yaitu 3 4 jam sebelumnya, agar hewan tersebut tidak mati. Hasilnya : marmut A tidak ada perubahan apa-apa dan marmut B terjadi eritema pada tempat penyuntikan selama 24 jam. Eritema ini akan menjadi nekrotik setelah 2 3 hari, menjadi ulkus.

FLUORESCENT ANTIBODY METHODE (FA) Untuk diagnosa cepat penyakit difteria di laboratorium sudah banyak digunakan, yaitu immuno fluorescence methode. Pemeriksaan ini untuk menunjukkan reaksi zat anti-antigen, secara tes langsung dari bahan usapan tenggorokan penderita yang disangkakan difteri. Sediaan yang telah dibuat dilihat dengan mikroskop fluorescensi.

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan C.diphteriae dalam medium Loeffler atau throat swab (usapan tenggorok pasien). 2. Biakan Bacilus subtilis. 3. Larutan zat warna : Neisser A, Neisser B, dan Neisser C Albert I dan Albert II 4. Media Loeffler, serum McLeod, agar darah. 5. Seri uji fermentasi karbohidrat : maltosa, glukosa, sukrosa dan laktosa. 6. ADS (antitoksin difteri serum). 7. Lidi kapas. YANG DIKERJAKAN : 1. Memperhatikan bentuk dan warna koloni C.diphteriae pada Loeffler serum atau Mc Leod dan agar darah, dan bandingkan hasilnya. 2. Melakukan pewarnaan C.diphteriae dari biakan atau throat swab dengan pewarnaan Neisser atau Albert. 3. Memperhatikan bentuk dan warna koloni Bacillus subtilis pada media agar darah. 4. Melakukan pewarnaan spora dari koloni Bacillus subtilis. 5. Lihat dibawah mikroskop hasil pewarnaan bakteri-bakteri diatas. 6. Periksalah seri fermentasi karbohidrat dari C.diphteriae. 7. Buat laporan praktikum. PERTANYAAN : Tuliskan sifat dan reaksi biokimia dari kuman yang tersebut di bawah ini :
Kuman C.diphteriae - Gravis - Mitis - Intermedius C.pseudodiphtericum C.xerosis C.pyogenes (haemolyticum) Hemolisa Toksin Glukosa Laktosa Maltosa Sukrosa Dekstrin

KEPUSTAKAAN : 1. Sembiring Sampurna, Bakteri Batang Gram Positif Aerob, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran, 1999. 2. Brooks, Butel, Morse. Jawetz, Melnick, & Adelberg. Mikrobiologi Kedokteran. (Medical Microbiology). Ed. 22. Penerbit Salemba. 3. Winn, Allen, Koneman, Janda, Procop, Schreckenberger, Woods. Konemans Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott Williams & Wilkins. Sixth Edition. 2006. 4. Levinson, Jawetz E. Medical Microbiology & Immunology : Examination & Board Review. International Edition. 7th edition. McGraw-Hill USA. 2003.

Praktikum ke VII MYCOBACTERIACEAE Penyusun : R. Lia Kusumawati TUJUAN : Melatih mahasiswa untuk mengetahui dan mengenal Bakteri Tahan Asam BTA (Acid Fast Bacteriae), dengan mempelajari dan mengerjakan : o Cara melakukan pewarnaan khusus. o Cara mengerjakan sputum dengan metode konsentrasi. o Memperhatikan dan mengenal media khusus yang dipergunakan untuk kultur BTA.

PENDAHULUAN : Mycobacteria adalah bakteri bentuk batang yang disebut Bakteri Tahan Asam yang berarti bahwa kuman tersebut setelah mengambil (mengikat) zat warna pertama (I) sulit untuk melepaskannya kembali walaupun dicuci dengan larutan asam atau alkohol. Hal tersebut merupakan sifat spesifik untuk kuman yang menimbulkan penyakit kronis pada manusia. Mycobacteriae dapat dibagi atas dua golongan besar : I. Classified Mycrobacteriae (Typical) yaitu Mycobacteriae yang telah dipastikan patogenitasnya. Misalnya: a. Mycobact. tuberculosis b. Mycobact. avium c. Mycobact. bovis d. Mycobact. leprae, dsb. II. Unclassified (Atypical) yaitu jenis Mycobacterie yang tidak dapat digolongkan ke dalam I. Ruyon (1975) menyebutnya : Anonymous Mycobacteria. Golongan ini terdiri dari:

a. Gol. Photocromogen : yaitu bila terkena cahaya warna koloni akan menjadi lebih tua misalnya: Mycobact. kansasi (Yellow bacillus) b. Gol. Scotocromogen : yaitu koloninya berwarna tetapi tidak dipengaruhi oleh cahaya, misalnya : Mycobact. scrofulaceum. c. Gol. Nonphotocromogen : yaitu koloni tidak berwarna dan cahaya tidak dapat merubahnya, misalnya : Mycobact. intracellulare (Battey strain) d. Gol. Rapid Growth : yaitu koloni berwarna dan tumbuh dengan cepat pada media sederhana (6-10 hari), misalnya : Mycobact. phlei dan Mycobact. smegmatis.

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat-sifat sbb : 1. Tidak dapat tumbuh pada media sederhana umum. 2. Hanya dapat tumbuh pada media khusus antara lain : a. Lowenstein Jehnsen Media. b. Okudo. c. Bahan dari sputum sebelum dikultur sebaiknya dikonsentrasikan terlebih dahulu. 3. Tumbuh sangat lambat, meskipun dalam kondisi yang optimal dalam waktu 2-3 minggu baru terlihat adanya koloni. 4. Bersifat tahan asam. 5. Obligat aerob. 6. Tidak berspora dan tidak bergerak.

IDENTIFIKASI : 1. Pemeriksaan sputum dengan pewarnaan Ziehl Neelsen atau dengan Tan Thiam HokDevulder. 2. Kultur sputum pada media khusus secara langsung atau setelah melakukan metode konsentrasi antara lain pada Lowenstein Jehnsen. 3. Macam-macam test identifikasi lainnya : a. Niacin test

b. Nitrate reduction test c. Catalase test d. Urease test

METODE KONSENTRASI : Sputum dikumpulkan selama 24 jam atau diambil sputum pagi pertama. Ambil sputum sebanyak a cc masukkan ke dalam tabung reaksi dan tambahkan a cc KOH 4%. Tabung itu ditutup dengan prop lalu kocok dengan campuran di atas selama 5 menit. Eramkan selama 30 menit pada 37C. Centrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Supernatan dibuang, sedangkan endapannya diambil dan dinetralisir dengan HCL 0,1 n (gunakan indikator Bromthymol blue). Endapan ini dapat dibuat sediaan untuk pewarnaan dan untuk kultur.

PEWARNAAN ZIEHL NEELSEN (lihat praktikum ke II) PEWARNAAN TAN THIAM HOK-DEVULDER : Pewarnaan ini biasanya dilakukan untuk pemeriksaan massal oleh karena cara pewarnaan ini lebih mudah dan tanpa pemanasan. - Bahan yang akan diperiksa difiksasi di atas kaca objek. - Genangi dengan larutan Kinyoun selama 5 menit. - Cuci dengan air selama menit. - Genangi dengan larutan Gabbet selama 1-5 menit. - Lihat di bawah mikroskop : Bakteri yang bukan tahan asam biru muda BTA :

o Merah o Bentuk batang tipis, ada granul (much granule) o Lurus atau agak bengkok o Susunan tidak teratur INSTRUKSI KERJA PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS: Sediaan apus harus diperiksa secara sistematis untuk memastikan bahwa hasil yang dilaporkan telah mewakili seluruh bagian sediaan. Jangan memeriksa sediaan sebelum kering.

Letakkan sediaan di atas meja mikroskop, permukaan sediaan menghadap ke atas. Gunakan lensa objektif 10 x untuk menetapkan fokus dan menemukan lapang pandang. Periksa sediaan untuk menentukan kualitas sediaan. Pada sediaan dahak umumnya ditemukan lebih banyak sel lekosit atau sel radang

Teteskan satu tetes minyak emersi, aplikator minyak emersi tidak boleh menyentuh kaca objek. Tetesan harus jatuh bebas ke permukaan sediaan apus agar aplikator minyak emersi tidak terkontaminasi dengan sediaan.

Putarlah lensa objektif 100x dengan hatihati ke atas sediaan apus. Jangan sekali-kali lensa menyentuh kaca sediaan. Sesuaikan fokus dengan hati-hati sampai sel terlihat jelas

Lakukan pembacaan sediaan apus sepanjang garis tengah dari ujung kiri ke kanan atau sebaliknya.

Laporkan hasil pemeriksaan mikroskopis dengan mengacu kepada skala International Union Against To Lung Disease (IUATLD)
Apa yang terlihat Hasil Apa yang dituliskan tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang Negatif Neg Tulis jumlah BTA

ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (tuliskan Scanty* jumlah BTA yang ditemukan) ditemukan 10 99 BTA dlm 100 lapang pandang ditemukan 1+

1+ 2+

1 10 BTA setiap 1 lapang pandang(periksa 2+

minimal 50 lapang pandang) ditemukan 10 BTA dalam 1 lapang pandang(periksa minimal 3+ 20 lapang pandang) 3+

* penulisan jumlah BTA pada hasil scanty adalah: +1, +2, +3, dst. hingga +9 sesuai dengan jumlah BTA yang dijumpai BAHAN PRAKTIKUM: 1. Biakan Mycobacterium tuberculosis pada media Lowenstein Jenhsen. 2. Biakan Atypical Mycobacteria (kalau ada). 3. Sputum yang mengandung Mycobacterium tuberculosis.

YANG DIKERJAKAN : 1. Perhatikan koloni dari Mycobacterium tuberculosis. 2. Buat sediaan pada kaca objek dari bahan sputum dan/atau dari koloni yang disediakan (hati-hati sebab bahan ini infectious). 3. Bahan sputum harus dikonsentrasikan terlebih dahulu agar lebih mudah diamati. 4. Setelah difiksasi dengan baik pada kaca objek, lalu dilakukan pewarnaan : Ziehl Neelsen atau Tan Thiam Hok-Devulder. 5. Periksa dengan mikroskop dengan pembesaran 1000 x menggunakan minyak imersi. 6. Buat laporan tentang apa yang dikerjakan.

PERTANYAAN : 1. Apa guna penambahan KOH 4% pada sputum pada metode konsentrasi? 2. Apakan sputum dari hasil konsentrasi dapat langsung dipakai untuk biakan? 3. Bagaimana cara pewarnaan Mycobact. tuberculosis dengan Auramin? 4. Bagaimana komposisi media Lowenstein Jenhsen dan media Okuda?

Mycobacterium leprae : Mycobacterium leprae mempunyai sifat sebagai berikut : 1. 2. 3. 4. Belum dapat dibiakkan pada media buatan (pada hewan dapat dikultur) Bersifat tahan asam Bentuk : batang tipis, lurus atau agak bengkok Susunannya : paralel (paralel bundles)

Preparat/sediaan untuk pemeriksaan : diambil Reiz serum dari pasien, fiksasi pada kaca objek dan diwarnai dengan pewarnaan BTA. Cara pengambilan Reiz serum :

1. Lesi pada kulit penderita (macula-papula), dijepit dengan pertolongan pinset sehingga bagian lesi lebih menonjol. 2. Dengan scalpel dilakukan sayatan kecil dan tipis pada bagian kulit tersebut (luka jangan terlalu dalam/tak boleh berdarah) sehingga keluar cairan jernih/serum (Reiz serum). 3. Sentuhkan kaca objek pada cairan tersebut di atas. 4. Lakukan fiksasi dengan memanaskan secukupnya sehingga cairan mengering pada kaca objek. 5. Sediaan siap untuk dilakukan pewarnaan BTA.

DIKERJAKAN : 1. Perhatikan perbedaan pengamatan secara mikroskopis antara Mycobact. tuberculosis dengan Mycobact. leprae. 2. Buat daftar yang menuliskan perbedaan sifat-sifat antara Mycobact. tuberculosis dan Mycobact. leprae. 3. Buat laporan pekerjaan dan pengamatan pada praktikum Mycobacteriaceae ini.

KEPUSTAKAAN 1. Brooks, Carroll, Butel and Stephen Morse. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, Twenty-Fifth Edition. Lange Basic Science. 2010. 2. George.PK., Hugo,L.D. The Mycobacteria. Gradwohls Clinical Laboratory Method and Diagnosis. Sonnenwill and Yarret Editions, C.U.Mosby Co 8th Ed.1980. 3. Ramlis B. Alimin. Penuntun Praktikum Mikrobiologi FK USU 2005. 4. Forbes , BA., Sahm, DF., Weissfeld, AS., Diagnostic Microbiology : Bailey & Scotts, 12th edition, Mosby, Missouri, 2007.

Praktikum ke VIII PERTUMBUHAN KUMAN ANAEROB Penyusun : Rahmat Sjah TUJUAN : Mengetahui tehnik isolasi kuman-kuman anaerob yang sering menyebabkan penyakit infeksi. PENDAHULUAN : Hingga kini dikenal dua konsep pemikiran mengenai kuman anaerob, yang pertama berorientasi pada adanya O2 pada lingkungan kuman baik yang berada pada perbenihan yang terikat secara kimiawi yang berperan sebagai penghambat pertumbuhan kuman anaerob (toksisitas O2); konsep pemikiran kedua adalah yang berorientasi pada kemampuan melepas elektron dari suatu lingkungan pertumbuhan anaerob atau yang dikenal juga dengan istilah Eh lingkungan (=potensial oksidasi reduksi suatu lingkungan).

TOKSISITAS O2 : Kuman aerob memerlukan O2 sebagai akseptor hidrogen dan tumbuh baik bila terdapat udara yang mengandung O2. Kuman anaerob memerlukan bahan lain sebagai akseptor hidrogen dan sensitif terhadap adanya O2. Toksisitas O2 disebabkan terbentuknya hidrogen peroksida (HO2O2) dan superoksida (O2). Superoksida suatu radikal bebas yang jauh lebih toksis. Untuk menghilangkan keadaan toksis ini diperlukan enzim superoksida dismutase yang menyebabkan terjadi reaksi : O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2 Kemudian enzim katalase menguraikan : 2H2O2 2H2O + O2 (gelembung gas)

Kuman anaerob memiliki kedua enzim tersebut : kuman anaerob aerotolerans menghasilkan enzim superoksida dismutase, sedangkan kuman anaerob obligat tidak memiliki kedua enzim tersebut, karena tidak dapat hidup bila ada O2. Konsep ini kiranya belum dapat menjawab berbagai masalah yang timbul baik dalam penyakit infeksi maupun pada orang sehat misalnya : Mengapa kuman anaerob dapat hidup pada lokasi tertentu dari permukaan mukosa saluran pernafasan, pencernaan dan genital sebagai bahan flora normal. Seperti kita ketahui bahwa pada lokasi tersebut bukanlah yang bebas dari O2. Mengapa kuman anaerob dapat sebagai penyebab infeksi pada otak dan dapat pula ditemukan pada penderita bakteremia padahal otak dan darah adalah bagian tubuh yang terbanyak mengandung O2. Eh (Potensial Redoks) : Yang dilakukan dengan Eh lingkungan adalah kemampuan lingkungan tersebut untuk melepaskan elektron. Makin rendah Eh suatu lingkungan berarti makin tinggi kemampuan lingkungan tersebut melepaskan elektron, ini berarti pula semakin baik lingkungan tersebut untuk pertumbuhan kuman anaerob. Eh yang baik untuk pertumbuhan kuman anaerob berkisar di antara -120 m Volt sampai 250 m Volt. Penurunan Eh suatu lingkungan dapat diperoleh : a. Secara kimiawi, dengan menambah zat-zat kimia misalnya glukosa, cystein HCl menadion (Vit K), hemin dan lain-lain pada lingkungan tersebut, misalnya pada perbenihan kuman invitro. b. Secara biologis, hal ini kita temukan pada mukosa saluran pernafasan, pencernaan dan genital. Hidup bersama antara kuman aerob dan kuman anaerob sebagai bagian dari flora normal pada lokasi tersebut dan menurunkan Eh lingkungannya. c. Secara biologis dan kimiawi, hal ini kita temukan apabila ada infeksi pada lokasi di mana kuman anaerob ditemukan sebagai bagian flora normal. Pada lokasi tersebut yang pertama-tama aktif dalam metabolismenya adalah kuman aerob yang juga terdapat sebagai flora normal pada lokasi ini. Metabolit yang dihasilkan ini akan membantu

merusak jaringan dan akan menghasilkan zat kimia lain yang membantu terwujudnya Eh rendah pada lingkungan tersebut. Keterangan-keterangan ini kiranya dapat menjawab masalah yang tidak dapat dijelaskan oleh konsep pemikiran pertama mengenai kuman anaerob (toksisitas O2).

TEKNIK ISOLASI : Dalam garis besarnya ada tiga cara utama : a. Sistem pengolesan tabung putar (the roll-steak tube) yang menggunakan tabung bebas oksigen dengan procedured anaerobically sterilized media. b. Ruangan (chamber) anaerob Dalam hal ini semua manipulasi dilakukan dalam suasana anaerob (atmosfer tanpa O2). c. Bejana anaerob Ada dua cara : 1. Dalam bejana anaerob yang menggunakan gas-pak sebagai generator H2 dan CO2 dan palladium sebagai katalisator. 2. Dengan bejana yang memiliki teknik evacuation-replacement, udara yang ada di dalam bejana dikeluarkan dengan bantuan pompa hisap. Kemudian dimasukkan campuran gas H2 dan CO2 dengan perbandingan 9 : 1 dan palladium sebagai katalisator. Penggunaan sistem pengolesan tabung putar dan ruangan anaerob membutuhkan peralatan dan cara yang lebih rumit karenanya tidak praktis dalam pemakaian rutin.

CARA KERJA BEJANA ANAEROB MEMAKAI GAS-PAK : 1. Masukkan perbenihan yang telah ditanamkan ke dalam bejana. 2. Buka pembungkus indikator (disposible anaerobic indicator) dan letakkan dalam bejana sedemikian rupa hingga sumbunya dapat dilihat. Indikator segera berubah menjadi biru begitu kontak dengan udara, tetapi akan hilang warnanya dalam suasana anaerob.

3. Buka generator H2 dan CO2 (gas-pak), aktivasi (dengan penambahan 100 ml air) dan letakkan dalam posisi tegak dalam bejana. 4. Bejana segera ditutup rapat, lalu eramkan di dalam inkubator. Pembacaan koloni dilakukan 24 jam kemudian. Bila pertumbuhan kurang baik pengeraman ulang dilakukan untuk 24 jam berikutnya.

CARA

KERJA

BEJANA

ANAEROB

DENGAN

TEKNIK

EVACUATION-

REPLACEMENT Bejana yang telah diisi biakan bakteri ditutup rapat kemudian udara yang terdapat di dalam bejana dihisap keluar dengan pompa hisap, sehingga manometer menunjukkan angka -660 mmHg. Ke dalam bejana kemudian dimasukkan gas CO2 sehingga manometer menunjukkan angka 0. Setelah 30-60 menit angka pada manometer akan menunjukkan minus (-). Hal ini disebabkan terjadinya ikatan antara H2 dengan O2 yang terdapat di dalam perbenihan; ini dapat diketahui dengan menghilangnya warna merah pada perbenihan yang mengandung resazurin sebagai indikator O2. Besarnya angka minus yang terjadi tergantung dari segar tidaknya perbenihan yang terdapat dalam bejana. Kemudian ke dalam bejana ditambahkan lagi H2, sehingga manometer menunjukkan angka nol kembali. Kemudian hubungan bejana dengan manometer dan pompa hisap dilepaskan, biarkan selama beberapa saat/jam, kemudian masukkan ke dalam inkubator.

MEDIA UNTUK ISOLASI KUMAN ANAEROB Media padat : o Nonselektif : misalnya Agar Brucella diperkaya dengan : Darah domba defibrinated 55 Vitamin K Hemin

o Selektif : misalnya Agar Brucella ditambahkan antibiotik, seperti kanamisin, vankomisin, dan lain-lain Media cair antara lain : o Kaldu thioglycolate o Kaldu Cook Meat Medium (CMM) o Kaldu Brain Heart Infusion (BHI) Kaldu thioglycolate dan cook meat medium mengandung bahan preduksi yang mempertahankan suasana anaerob: kuman anaerob dapat tumbuh pada bagian dasar media tersebut meskipun tanpa menggunakan bejana anaerob, karenanya di samping untuk isolasi kuman anaerob kaldu thioglycolate dan cook meat medium bisa pula digunakan sebagai back up media. Media semi solid : o Media Cary Blair o Media Stuart Digunakan sebagai media transportasi spesimen (bahan pemeriksaan) anaerob.

BAHAN PRAKTIKUM 1. Biakan kuman Clostridium sp. pada Brucella agar 2. Cooked Meat Medium

YANG DIKERJAKAN 1. Memperhatikan biakan pada Cooked Meat Medium. 2. Memperhatikan koloni dari biakan pada media Brucella Agar. 3. Melakukan pewarnaan Gram dan pewarnaan spora. 4. Melihat morfologi sel bakteri di bawah mikroskop. 5. Buat laporan praktikum.

DEMONSTRASI Bejana anaerob dan Gas Pak

KEPUSTAKAAN : 1. A. Rahim, Suharto, Sujudi, Lina Isjah : Hasil Perkembangan Teknik Isolasi Bakteri Anaerob dari Bahan Pemeriksaan Klinik Selama Tahun 1979 di Jakarta, MKI : vo, 3(3-4), 1981. 2. A. Rahim : Kuman Anaerob dan Beberapa permasalahannya. Lokakarya Anaerob Pra KONAS I-IAMKI, Jakarta 13-18 Juli 1987. 3. Finegold, S.M. : Anaerob Bacteria in Human Disease. Academic Press, New York, San Fransisco, London, 1977. 4. Iswara, R : Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran, Jilid II. Dikeluarkan oleh Bagian Mikrobiologi FK-USU Medan 1976. 5. Jawetz, E, Melnick, J.L., Adelberg. E.A. : Review of Medical Microbiology, 16th edition. Lange Medical Publication, USA, Maruzen Asia, Singapore,1984. 6. Rahmat Sjah, Gerben F. Hutabarat, Ramlis B. Alimin : Bakteri-bakteri Anaerob. Naskah Pertemuan Ilmiah Infeksi Anaerob, Medan, 1987. 7. Sutter, V.L., VargoV.L., Finegold, SM. : Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual. 3rd edition. The C.V. Mosby Co. St. Louis, Toronto, London, 1980. 8. Willis, A.T. : Anaerobic Bacteriology Clinical and Laboratory Practice. 3rd edition. Butterworths London, Boston, 1977. 9. Balows, A et al (eds) : Manual of Clinical Microbiology. 5th edition. American Society for Microbiology Washington. D.C., 1991. 10. Mims, CA et al : Medical Microbiology, Mosvy Europe Limited, 1993.

11.Brooks, G.F., Butel, J.S., Ornston, L.N., Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A. Jawetz, Melnick & Adelbergs, Mikrobiolog Kedokteran (Medical Microbiology), Edisi 22, 2001, (Terjemahan oleh Bagian Mikrobiologi FK Universitas Airlangga). 12.Levinson, W., Jawetz E., Medical microbiology & immunology : examination & board review, International Edition, 7th edition, McGraw-Hill, USA, 2003.

Praktikum ke IX

TES KEPEKAAN ANTIMIKROBA Penyusun : Edhie Djohan Utama

TUJUAN : Mempelajari cara-cara uji kepekaan bakteri penyebab infeksi terhadap antimikroba.

PENDAHULUAN Tes kepekaan (susceptibility test) atau uji kepekaan atau tes resistensi, yaitu tes untuk mengetahui apakah bakteri peka (susceptible), kurang peka (intermidiate) atau tidak peka (resistant) terhadap antimikroba,. Tes Kepekaan dapat dilakukan dengan cara. yaitu : 1. Cara Difusi (Difusion Methods) 2. Cara Pengenceran (Dilution Methods) Cara yang rutin adalah cara difusi memakai cakram kertas atau tablet berisi antimikroba tertentu
I. Tes Kepekaan Cara Difusi : (Kwalitatip) 1. Lempeng Agar : Tebal lempeng agar 4 mm.

Media harus dapat ditumbuhi oleh bakteri yang akan di uji. 2. Diambil beberapa koloni bakteri yang akan diuji kepekaannnya dan dimasukkan ke medium cair, eramkan 2-5 jam pada 36o-37oC

> 25 mm

3.Cara penyemaian bakteri : Kapas lidi steril dicelupkan kedalam medium cair yang berisi bakteri (ad.2) lalu disemaikan kepermukaan Lempeng Agar (ad.1) sehingga tersebar merata. Biarkan 3-5 menit (jangan lebih dari 15 menit) 4.Cakram antimikroba diletakkan pada permukaan lempeng agar (ad.3) dengan bantuan pinset steril dan ditekan sedikit agar melekat dengan baik. Eramkan pada suhu 37 C selama 18-24 jam. 5. Mengukur daerah hambatan : Daerah hambatan di sekitar cakram antimikroba yang tidak ditumbuhi oleh koloni bakteri diukur diameternya dengan jangka sorong (kaliper) atau
penggaris, lalu disesuaikan dengan tabel. Eramkan 20 24 jam

Pengukuran daerah hambatan dalam mm.

II. Tes Kepekaan Cara Pengenceran

Kwantitatip Akurat Biasanya dilakukan untuk keperluan penelitian atau dilakukan di pabrik obat untuk

menentukan dosis antimikroba. Memakai media cair.

KHM/Konsentrasi Hambat Minimum (MIC) adalah kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. KBM/Konsentrasi Bunuh Minimum (MBC) adalah kadar atau pengenceran tertinggi dimana pada kadar tersebut antimikroba dapat mematikan bakteri.

A. Methode Pengenceran Cara Makro dalam seri 12 tabung (Standard Test)

Prinsip : Menggunakan 12 tabung reaksi ( 2 tabung terakhir sebagai kontrol). Antimikroba diencerkan kelipatan 2 (Antimikroba diencerkan kelipatan dua (1ug, 0,5 ug, 0.25 ug. 0.125 ug, dst hingga tabung ke 10, tabung ke 11 kontrol negatip dan tabung ke 12 kontrol positip). 1. Kedalam masing masing tabung dimasukkan media cair 1 cc (Mueller Hinton Broth). 2. Buatlah larutan antimikroba dari stock solution yang diketahui konsentrasinya lalu buatlah larutan yang diinginkan konsentrasinya. (misalnya 2 ug/cc) 3. Masukkan 1 cc larutan tersebut ke dalam tabung pertama memakai pipet steril, aduklah agar homogen, dan sedotlah 1 cc lalu pindahkanlah ke tabung kedua dan aduklah lagi agar homogen. Demikian seterusnya hingga tabung ke 11. 4. Pindahkan 1 cc larutan dari tabung ke-2 ke tabung ke-3 dst-nya sedemikian sehingga sampai ke tabung ke 11. 5. Jadi tabung 1 s/d dengan tabung ke 11 berisi antimikroba dengan konsentrasi kelipatan 2. 6. Lalu buanglah 1 cc dari tabung ke 11. 7. Tabung 11 ditambahkan beberapa tetes formalin (F) , sebagai kontrol negatip (K -). 8. Tabung 12 sebagai kontrol pertumbuhan (K +).
9. Kedalam setiap tabung ditambahkan 1 cc suspensi bakteri yang akan di uji kepekaannya,

sehingga kadar antibiotik menjadi separuh dari konsentrasi awalnya. 10. Eramkan rak berisi tabung-tabung tersebut dlm inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam. 11. Setelah 24 jam keluarkan rak dan perhatikan pada tabung keberapakah cairan media menjadi

keruh (ada pertumbuhan). Bandingkan dengan tabung ke-12 (K+). Tabung yang tak ada pertumbuhan dibandingkan dengan tabung K-. 12. Pada pengenceran tertinggi (tabung ke berapa) tidak terdapat pertumbuhan bakteri,
a. Misalnya pada tabung ke 4 (konsentrasi adalah 0,125 ug/cc)

b. Dengan demikian KHM (MIC) adalah 0,0625 ug/cc.

B. Methode Pengenceran Cara Mikro : Menggunakan : Microtiter plate Microtiter diluter Microtiter dropper

Kontrol : Untuk mengetahui apakah antimikroba itu tidak rusak dan media adalah sesuai dan bisa ditumbuhi oleh bakteri, maka digunakan bakteri strain standard sebagai kontrol. ( Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 )

BAHAN PRAKTIKUM : Media Mueller Hinton agar yang telah diisi beberapa disk antimikroba dengan bakteri sesuai strain kontrol.

YANG DIKERJAKAN : 1. Amati dan ukurlah diameter hambatan di sekitar antimikroba, sesuaikan dengan ukuran standar inhibisi. 2. Tulis masing masing cakram yang digunakan dan laporkan sensitivitasnya. 3. Buat laporan praktikum.

Antibiotic Susceptibilities Antibiotic disc Against Sp

Modified Kirby Bauer Method Resistant Intermidiate Suscept

Amikacin (AN-30), 30ug Amoxicillin/Clav. Acid (AMC30) Ampicillin (AM-10), 10ug Staphylococcus Others Enterobacteriaceae Staphylococcus Enterococcus Cefotaxime (CTX-30), 30ug Cefotiam (CTM) 30 ug Ceftazidime (CAZ-30), 30ug Cefuroxime (CXM-30) 30ug Cephalexin (Cl), 30ug Cephalothin (KF), 30ug Chloramphenicol (C), 30ug Ciprofloxacin (CIP-5), 5ug Doxycycline (D-30), 30ug Erythromycin (E-15), 15ug Fosfomycin (FOS) 50 ug

<14 < 19 < 13 <13 <28 <16 < 14

15 - 16 14 - 17 14 - 16 15 - 22

> 17 > 20 > 18 > 17 > 29 >17 > 23

< 14 < 14 < 14 < 14 < 12 < 15 < 12 < 13 < 13

15 - 17 15 - 22 15 - 17 15 - 17 13 - 17 16 - 20 13 - 15 14 - 22 14 - 19

> 18 > 23 > 18 > 18 > 18 > 21 > 16 > 23 > 20

Z Gentamycin (GM-10), 10ug O N

Except high resistant enterococcus

< 12

13 - 14

> 15

Imipenem ( IPM-10), 10ug

E

< 13 < 13 Staphylococcus <9 < 13 < 14 < 12 Staph.aureus Staph Negative coag. < 10 < 17 < 28 < 14 < 17 < 17 < 16 < 14 < 10 9

14 - 15 14 - 17 10 - 13 14 - 18 15 - 16 13 - 15 11 - 12 15 - 19 17 - 19 15 - 18 11 - 15 10-11

> 16 > 18 > 14 > 19 > 17 > 16 > 13 > 18 > 29 > 15 > 18 > 20 > 20 > 19 > 16 12

Kanamycin (K-30), 30ug

S Methicillin (Met), 5ug

Nalidixic Acid (NA-30), 30ug

Z

Nitrofurantoin (F/M), 300ug Norfloxacin (NOR),10ug Oxacillin (OX-1), 1ug

Penicillin (P-10), 10 units

Staphylococcus Enterococcus

Piperacillin (PIP), 100ug and Tazobactam+Piperacillin (TZP) 100 ug Rifampin Tetracycline (TE-30), 30ug Trimethoprim (TMP-5) 5ug Vancomycin (Va-30), 30ug

Pseudomonas Other Gr (-)

Praktikum X

JAMUR-JAMUR OPORTUNISTIK
Penyusun : Sofyan Lubis

TUJUAN : Agar mahasiswa dapat memahami metode pemeriksaan dan mengidentifikasi klinik dan

jamur-jamur opportunistik (opportunistic fungi) yang diisolasi dari spesimen dibiakkan di media laboratorium.

PENDAHULUAN Jamur-jamur yang selama ini dianggap sebagai kontaminan ,sebenarnya mempunyai latent pathologic capabilities yang akan manifest atau muncul jika ada faktor- faktor

predisposisi yang dapat menyebabkan menurunnya daya tahan tubuh., misalnya pada pasien immunocompromised. Meskipun setiap jamur dapat menjadi opportunist, tapi yang paling sering
rutine

diisolasi dari spesimen klink adalah : Aspergillus spp., Mucor spp, Rhizopus, dan Candida spp.
Pemeriksaan Koloni Jamur yang Tumbuh di Medium

Pemeriksaan

secara makroskopis :

1. Appearance of the growth 2. Rate of growth 3. Colony pigmentation 4. Growth on media containing antifungal agents 5. Dimorphic fungi

Pemeriksaan secara mikroskopis dengan cara : 1. Tease mount 2. Cellophane tape mount
3. Slide cultur

Mucor spp. dan Rhizopus spp.

Kedua jamur diatas tergolong dalam divisi Zygomycota yang menyebabkan

zygomycoses, suatu infeksi jamur oportunistik pada manusia. Infeksi terjadi jika spora-spora dari jamur tersebut terhirup ke dalam paru-paru.

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan Mucor spp, dan Rhizopus spp, di lempeng Agar Sabouraud. 2. Biakan Mucor spp dan Rhizopus spp di potongan tempe dan roti.

YANG HARUS DIKERJAKAN :

1. Mengamati koloni-koloni

jamur

di lempeng Agar Sabouraud.

2. Buat

sediaan basah dengan Lactophenol cotton blue sebagai mounting fluid

dengan metode cellophane tape mount. 3. Observasi struktur-struktur berikut : a. Hifa bersepta atau tidak bersepta b. Sporangiophora bercabang atau tidak bercabang c. Sporangium masih utuh atau telah pecah d. Columella e. Rhizoid : ada atau tidak ada. f. Buat gambar skematis dari Mucor spp dan Rhizopus spp.

Aspergillus spp. dan Penicillium spp.

Aspergillus spp. adalah penyebab dari aspergillosis, suatu infeksi jamur oportunistik pada manusia. Infeksi terjadi jika spora-spora dari jamur tersebut terhirup ke dalam paru-paru. Sedangkan satu-satunya marneffei. spesies Penicillium yang primer patogen adalah Penicillium

BAHAN PRAKTIKUM :
1. Biakan Aspergillus spp. dan Penicillium spp. di lempeng Agar Sabouraud

2. Biakan Aspergillus spp. dan Penicllium spp. di potongan tempe dan roti

YANG DIKERJAKAN : 1. Mengamati koloni-koloni jamur 2. Buat di lempeng Agar Sabouraud

sediaan basah dengan Lactophenol cotton blue.

3. Observasi struktur-struktur berikut : a. Hifa bersepta atau tidak bersepta b. Conidiophora bercabang atau tidak bercabang c. Phialides atau sterigma dan rantaian konidia d. Vesicle ada atau tidak e. Foot cell : ada atau tidak . 4. Buat gambar skematis dari Aspergillus spp. dan Penicillium spp. 5. Apa beda struktur keduanya.

CANDIDA ALBICANS dan CANDIDA SPECIES TUJUAN Mengenal morfologi koloni Candida sp. yang merupakan bagian dari flora normal
di tubuh manusia, tapi dapat menimbulkan penyakit pada pasien - pasien immunocompromised.

Koloni Candida sp. di Agar Sabouraud: 1. Sedikit timbul di permukaan medium 2. Permukaan koloni halus, licin atau berkerut 3. Berwarna putih ke kuningan 4. Berbau manis ( bau ragi tape)

Struktur yang perlu diperhatikan secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram :

Sel-selnya bentuknya oval, lonjong atau bulat Budding sel Pseudohifa Blastospora

Diagnosis laboratorium Candida albicans : 1. Pembentukan germ tube di medium serum atau plasma 2. Pembentukan chlamydospora di medium cornmeal agar 3. Pembentukan koloni seperti kaki laba-laba ( spiderlike) di medium Levine EMB 4. Reaksi fermentasi dan assimilasi karbohidrat ,dan assimilasi nitrat.

BAHAN PRAKTIKUM : 1. Biakan Candida sp. di medium Sabouraud agar 2. Biakan Candida sp. di medium Agar Darah

YANG DIKERJAKAN : 1. Buat sediaan yang diwarnai dengan Gram 2. Periksa khlamidospora dan blastospora di slide culture

Pertanyaan : Apa beda pseudohifa dan germ tube pada Candida albicans ?.

Germ-tube test : 1. Dengan plastic loop sterile sentuh sedikit pure colony.

2. Suspensikan sel-sel di dalam serum fetal calf, bovine, rabbit, atau manusia ( 0.3 0.5 ml pada suhu kamar), dan usapkan loop ke dinding tabung ( 75 x 12 mm ). 3. Eramkan serum culture : 37C, 2,5 3 jam. 4. Dengan plastic loop, ambil satu drop serum culture dan letakkan di atas kaca slide ,

kemudian tutup dengan cover slip. 5. Periksa sediaan ini, mula-mula dengan low-power objective ( 100 x ) untuk melihat lokasi group of cells dan kemudian konfirmasikan keberadaan germ tubes dengan OIO (objective immersion oil : 1000 x).

Praktikum XI UJI SEROLOGI Penyusun : Gerben F. Hutabarat

A. TUJUAN: Agar mahasiswa dapat memahami cara pemeriksaan serologi berdasarkan reaksi antigen-antibodi dan interpretasi hasil pemeriksaan spesimen klinis.

B. PENDAHULUAN Infeksi Treponema pallidum yang terjadi pada seseorang yaitu melalui hubungan seksual atau cara lain akan menunjukkan kelainan melalui beberapa fase, dan penyakitnya disebut sifilis. Fase pertama terjadi apa yang disebut lesi primer terlihat berupa ulkus (ulcus durum) dan disebut juga hard chancre yang dijumpai pada alat kelamin. Pada lesi ini dijumpai T. pallidum banyak sekali (T. pallidum +++), dijumpai pula proliferasi pembuluh darah dan bertumpuknya plasma sel. Lesi primer akan sembuh sendiri setelah 2-10 minggu. Dari abrasi kulit pada alat kelamin, T. pallidum juga sampai pada kelenjar lymph dan multiplikasi di daerah tersebut. Melalui aliran darah akan sampai ke jaringan tertentu pada tubuh dan akan terjadi lesi sekunder berupa ruam makula-papula merah dan dapat juga berupa papula pucat-basah yang disebut kondiloma. Lesi ini dapat terjadi pada regio anogenital, axilla, mulut, vagina dan anus, ini terjadi 6-8 minggu sesudah lesi primer. Pada lesi sekunder juga dijumpai T. pallidum dalam jumlah banyak dan sangat menular. Lesi sekunder juga akan sembuh sendiri. Kurun waktu 3-5 tahun kemudian akan terjadi fase laten (fase lanjutan) yang juga menular. Walaupun fase ini tanpa gejala tetapi hasil uji serologi adalah positif.

C. UJI SEROLOGI Uji serologi pada penyakit sifilis selalu disebut Serology Test for Syphillis (STS), adalah uji untuk mendeteksi antibodi.

Pada penderita sifilis terbentuk 2 jenis antibodi yaitu: 1. 2. Reagins (antibodi non spesifik) Antibodi spesifik Uji serologi yang dilakukan untuk mendeteksi antibodi pada penderita sifilis diantaranya adalah:

I. Uji serologi nonspesifik (tes nonspesifik = Reagins test) Uji ini adalah untuk mendeteksi antibodi reagins dengan menggunakan cardiolipin sebagai antigen. Reagins adalah antibodi campuran IgM dan IgA, yang ditemukan pada serum penderita sifilis setelah 2-3 minggu penderita mendapat infeksi T. pallidum yang tidak diobati. Antibodi ini juga ditemukan dalam cairan spinal 4-8 minggu sesudah infeksi. Selain dijumpai pada penderita sifilis, reagins juga dijumpai pada penderita penyakit lain yaitu malaria, lepra, mononucleosis infectiosa, measles (campak), juga pada penyakit collagen vascular yaitu: Systemic Lupus Erythematosus, polyarthritis nodosa dan lain-lain. Cardiolipin adalah antigen non spesifik yang terdiri dari fosfolipid yang diekstrak dari jantung sapi yang normal dan diolah dengan lecithin dan cholesterol. Tes Nonspesifik (Reagins Test): a. Tes Flokulasi (flocculation test) yaitu: VDRL (venereal disease research laboratory) test RPR (rapid plasma reagin) test Kahn test

b. Tes Ikatan Komplemen (complement fixation test) yaitu: Wassermann test Kolmer test

II. Uji Serologi Spesifik (tes spesifik) Pada uji (test) ini dipakai antigen dari T. pallidum. Beberapa contoh uji ini adalah: a. TPHA (T. pallidum haemagglutination) test b. TPI (T. pallidum immobilization) test c. FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absorbed) test

D. RAPID PLASMA REAGIN (RPR) TEST

Uji rapid plasma reagin adalah salah satu uji nonspesifik yang termasuk dalam flocculation test.

Disediakan: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Serum penderita Suspensi antigen (Ag susp) berisi cardiolipin dan partikel carbon Serum kontrol positif (+ control) Serum kontrol negatif (- control) Kartu untuk tempat pengujian (test card) dengan ditandai 2 lingkaran Batang pipet plastik dengan suction cap Batang plastik pengaduk

Cara Kerja:

KEPUSTAKAAN 1. Bailey, W.R. and Scott. E.G. 1988, Diagnostic Microbiology 5th ed, Saint Louis 2. Barata Widjaja, K.G., 2000, Imunologi Dasar, 14th ed, Balai Penerbit FK UI Jakarta. 3. Finegold, S.M., Martin, W.J., 1982, Diagnostic Microbiology 6th ed, The C.V. Mosby Company, St. Louis. 4. Kresno, S.B., 1996, Imunologi Diagnostik dan Prosedur Laboratorium, ed. 3, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta. 5. Roitt, I. 1997, Essential Immunology, Oxford Blackwell Science. 6. Widmann, F.K. 1995, Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium ed 9, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.