COURSE STUDY GUIDE

TUTORIAL DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS BIOLOGI

MOLEKULER MAHASISWA TINGKAT 2 SEMESTER 3

KASUS I

Penanggung Jawab MK :
Nurhidayanti, S.Si., M.Kes

PROGRAM STUDI DIV TEKNOLOGI LABORATARIUM MEDIS

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
INSTITUT KESEHATAN DAN TEKNOLOGI
MUHAMMADIYAH PALEMBANG
TAHUN AKADEMIK 2019/2020
 SKENARIO KASUS

Seorang ATLM ditugaskan untuk melakukan pemeriksaan di desa sukasenang karena terjadi
suatu penyakit yang hampir menyerang seluruh warga. Warga mengalami keluhan yang sama
yaitu demam yang naik turun dan teratur disertai mengiggil. Untuk mengatasi penyakit
tersebut secara cepat seorang ATLM melakukan pemeriksaan biologi molekuler untuk
mengetahui penyakitnya dan segera dilakukan pengobatan supaya tidak menyebar ke warga
lainya. Sebelum melakukan analisis molekuler,ATLM melakukan pemeriksaan screening
berupa sedian apus darah tipis dan ditemukan trofozoit muda berbentuk cincin didalam
eritrosit ?

1. Step 1
a. Bengkak

b. Sakit

c. Diplococus

d. Monococus

e. Tetracocus

f. Sarkina

g. Staphylococcus

h. Streptococus

2. Step 2

a. Apakah keluhan yang dialami oleh warga?

b. Apakah pemeriksaan yang secara cepat dapat mengatasi penyakit warga?
c. Apakah pemeriksaan screening yang dapat dilakukan sebelum melakukan pemeriksaan
biologi molekuler?
d. Alat apa yang digunakan untuk pemeriksaan kasus tersebut ?
e. Bagaimana pemeriksaan yang akan dilakukan oleh ATLM ?
f. Apa penyakit yang dialami pasien berdasarkan hasil screening?
3. Step 3

a. Warga mengalami keluhan yang sama yaitu demam yang naik turun dan teratur serta
menggigil
b. Seorang ATLM dapat melakukan pemeriksaan biologi molekuler
c. Pemeriksaan screening yang dapat dilakukan adalah pemeriksaan sediaan apus darah
tipis untuk menemukan tropozoit muda yang berbentuk cincin
d. Alat yang digunakan untuk pemeriksaan antara lain :
1. Menggunakan cara manual pemeriksaan screening sebagai tes pendahuluan dengan
metode membuat apusan darah dan diamati menggunakan mikroskop.
2. Pemeriksaan biologi molekuler yaitu dengan ekstraksi lalu pemurnian menggunakan
spektrofotometer.
3. Menggunakan PCR (polymerase chain reaction) dan elektroforesis.

e. Dengan melihat gejala dan tanda klinis yang muncul secara umum. Untuk dilakukan
pemeriksaan mikroskopik untuk meningkatkan validasi diagnosis sehingga
pelaksanaannya dapat dilakukan dengan tepat (Arsin dkk,2012) sebagai pemeriksaan
screening. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan biologi molekuler menggunakan PCR.
f. Diduga terkena malaria karena ditemukan nya trofozoit muda berbentuk cincin. Malaria
merupakan salah satu penyakit menular yang masih menjadi masalah kesehatan
masyarakat di dunia termasuk Indonesia,malaria disebabkan oleh parasit darah perifer
dari genus plasmodium. Genus plasmodium memiliki lima spesies yang dapat
menyebabkan infeksi pada manusia yaitu plasmodium malariae,plasmodium
vivax,plasmodium ovale,dan plasmodium falciparum (Hamid dkk,2016).

4. Step 4

A. Pra analitik
Tahap pra analitik yaitu tahap mulai mempersiapkan pasien,menerima spesimen atau
sampel,memberi identitas spesimen,mengambil spesimen,menyimpan spesimen.
1. Formulir permintaan pemeriksaan
Apakah identitas pasien,identitas pengirim,nomor laboratorium,tanggal
pemeriksaan,permintaan pemeriksaan apakah sudah lengkap dan jelas.
 Apakah semua permintaan pemeriksaan sudah ditandai,sebelum melakukan
pemeriksaan perlu diperhatikan identifikasi dan pencatatan data pasien yang benar.
2. Persiapan Pasien
Apakah persiapan pasien sesuai persyaratan dan membuat petunjuk tertulis untuk
persiapan pasien pada setiap pemeriksaan laboratorium.
3. Pengambilan dan penerimaan pasien
Apakah spesimen dikumpulkan secara benar,dengan memperhatikan jenis
spesimen.
4. Penanganan spesimen
Apakah pengolahan spesimen dilakukan sesuai persyaratan,apakah penanganan
spesimen sudah benar untuk pemeriksaan khusus.
5. Persiapan alat dan bahan (Ginting,2019).
6. Cara melakukan pengambilan sampel darah
Alat, bahan :
a. Spuit ukuran 5-10 cc
b. Kapas alkohol dan tempatnya
c. Antikoagulan
d. Botol /tabung penampung darah
e. Tourniquet
f. Sarung tangan bersih

Prosedur
1. Cuci tangan
2. Gunakan sarung tangan
3. Jelaskan prosedur yang akan dilakukan
4. Ambil spuit sesuai dengan ukuran (5-10 ml )
5. Tentukan vena yang akan diambil darahnya
6. Desinfeksi dengan kapas alkohol
7. Lakukan pengikatan dengan karet pembendung dibagian atas vena yang akan
diambil darhnya
8. Lakukan pengambilan darah dengan cara menusukkan vena dengan jarum spuit
menghadap keatas dengan sudut 30 – 45 derajat terhadap kulit ,kemudian lepas
karet pembendung dan lakukan pengambilan darah
 9. Setelah darah diambil,masukkan ke dalam botol penampung yang telah diberi
antikoagulan sesuai dengan jenis pemeriksaan dan tekan daerah penusukan
selama 2 – 5 menit
10. Catat tanggal pengambilan
11. Buka sarung tangan
12. Cuci tangan ( Hidayat, 2008).

B. Analitik
1. Pemeriksaan apus darah tipis
Alat dan bahan :
Alat
a. Dua objeck glass
b. pipet tetes
Bahan
a. Sampel darah
b. Methanol pa (Absolute )
c. Giemsa
Prosedur kerja :
a. Objeck glass pertama digunakan untuk tempat tets darah yang akan
diperiksa dan ojeck glas kedua untuk meratakan tetes darah agar didapat
lapisan tipis .
b. Objeck glass untuk meratakan darah diletakkan miring dengan sudut kira-
kira 45̊ dan digerakkan secara cepat sehingga terbentuklah selapis tipis.
c. Sampel darah dikeringkan pada suhu ruang dan dilakukan fiksasi
menggunakan methanol pa (absolute) yaitu dengan cara meneteskan
methanol ke seluruh apusan darah
d. Apusan darah dibiarkan sampai kering pada suhu ruang. Setelah kering
apusan darah diwarnai dengan pewarna giemsa menurut metode Giemsa
dan Wright yang merupakan modifikasi metode Romanosky
(Yuniastutik,2019).
C. Pemeriksaan biologi molekuler
1. Prosedur kerja ekstraksi dan isolasi DNA menggunakan sampel darah
(Ekstraksi: fenol chloroform)
Alat dan Bahan :
Alat
a. Biosafety Cabiner
b. Refrigerated Centrifuge
c. Waterbath
d. Vortex
e. Refrigerator
f. Microtube 1,5 ml /tube
g. Mikropipet
Bahan
a. Sampel Darah Whole Blood
b. Cell Lysis Solution
c. Nueler Lysis Solution
d. Protein Precipitation
e. Isopropanol
f. Etanol 70 %
g. DNA Rehydration Solution

Prosedur Kerja
1. Untuk sampel volume 300 µl Tambahkan 900 µl. Cell lysis sokution pada
microtube steril 1,5 ml untuk sampel volume 3 ml. Tambahkan 9,0 ml cell
lysis solution pada tube steril 9,0 ml . penting : darah harus diambil
menggunakan tabung antikoagulan EDTA ,heparin ,atau citrate untuk
mencegah clotting
2. Homogenkan tabung darah secara perlahan hingga benar- benar homogen
lalu pindahkan darah microtube steril yang telah berisi cell lysis solution.
Homogenkan dengan cara dibolak balikan tabung 5-6 kali
3. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang ( homogenkan dengan cara
dibolak balikan tabung 2- 3 kali selama inkubasi ) untuk melisiskan sel
darah merah. Sentrifuge pada 2000 x g selama 10 menit pada suhu ruang
untuk sampel ml
4. Buang dan hilangkan supernatan yang terbentuk sebanyak mungkin tanpa
merusak pellet putih yang nampak. Kira-kira 10-20 µl cairan residu yang
akan tetap pada microtube 1,5 ml (300 µl sampel ) kira-kira 50-100 µl.
Cairan residu yang akan tetap ada pada tube steril 15 ml , 3 ml sampel jika
sampel darah membeku ,ulangi tahap 1-4 hingga terbentuk pellet putih
mungkin saja beberapa DNA hilang pada sampel yang membeku.
CATATAN. Beberapa sel darah merah atau sel yang rusak akan terlihat
selama masih bercampur dengan sel darah putih ,jika pellet dalam
microtube/tube hanya sel darah merah saja . tambahkan ahquat cell lyis
solution setelah membuang supernatant sel pellet lalu ulangi langkah 3-4
5. Vortex tube dengan kuat hingga sel darah putih menjadi resuspend (10-15
detik )
6. Tambahkan nuclei lysis solution (300 µl untuk volume sampel 300 µl , 3,0
ml untuk volume sampel 3 ml ) pada tube yang mengandung sel resuspend
pipet larutan 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih larutan harus kental.
Jika sel menggumpal setelah pencampuran. Inkubasi pada 37̊ C hingga
gumpalan hancur .jika gumpalan tetap terlihat setelah 1 jam .tambahkan
nuclear lysis solution (100 µl untuk volume sampel 3 ml ) lalu inkubasi
diulang
7. OPTIONAL . tambahkan RNAse solution (1,5 µl untuk volume sampel
300 µl .15µl untuk volume sampel 3 ml ) untuk melear lysateb , dan
homogenkan sampel 2-5 kali. Inkubasi pada 37̊ C selama 15 menit dan
dinginkan pada suhu ruang
8. Tambahkan protein precipitation solution (100 µl untuk volume sampel
300 µl , 1,0 ml untuk vlume sampel 3 ml untuk nuclear lysate dan vortex
kuat selama 10-20 detik gumpalan protein kecil akan terlihat setelah vortex
. CATATAN . jika penambahan nuclear lysis solution telah ditambahkan
tahap 6, tambahkan 130 µl. Protein precipitation solution untuk volume
sampel 300 µl dan 1,3 ml. Protein precipitation solution untuk volume
sampel 3 ml.
9. Sentrifuge 13000-16000 x g selama 3 menit pada suhu ruang untuk
volume sampel 300 µl . sentrifuge 2000 xg selama 10 menit untuk pada
suhu ruang untuk volume sampel 3ml. Pellet protein harus terlihat
berwarna coklat gelap .jika tidak ada pellet yang terbentuk ,lihat langkah 4
 10. Untuk volume sampel 300 µl ,pindahkan supernatant ke microsentrifuge
steril 1,5 ml yang mengandung 300 µl isopropanol (suhu ruang ) untuk
sampel 3 ml pindahkan supernatan ke tube steril mengandung 3 ml
isopropanol (suhu ruang ) CATATAN. Tinggikan cairan sisa dalam tabung
untuk menghindari kontaminasi
11. Secara perlahan homogenkan larutan hingga terlihat bentuk untaian seperti
benang putih
12. Sentrifuge 13.000 x g selama 1 menit pada suhu ruang untuk sampel
volume 300 µl . sentrifuge 2.000 x g selama 1 menit pada suhu ruang
untuk sampel volume 3 ml .DNA akan terlihat seperti pellet putih.
13. Tuang supernatant dan tambahkan sebanyak volume sampel ethanol 70%
(suhu ruang ) pada pellet DNA. Secara perlahan homogenkan dengan cara
dibolak balik tube beberapa kali untuk mencuci pellet DNA dan pada sisi-
sisi microtube. Sentrifuge seperti tahap 12
14. Perlahan pipet ethanol menggunakan pippet pasteur atau micropipet pellet.
Pellet DNA rentan sehingga ujunng pipet tidak boleh menyentuh pellet
DNA. Balikkan tabun pada kertas penyerap bersih dan keringkan pellet
selama 10-15 menit.
15. Tambahkan DNA Rehydration Solution ( 100 µl untuk volume sampel
300 µl.,250 µl untuk volume sampel 3 ml.) pada tabung dan rehyrate DNA
dengan menginkubasi pada 65 ̊C selama 1 jam. Sesekali campurkan larutan
secara hati-hati untuk alternatif, rehydrate DNA dengan menginkubasi
larutan selama seharian pada suhu ruang atau 4 ̊ C
16. Simpan DNA disuhu 2-8 ̊ C (Djuminar dan Fusvita,2020).

2. Prosedur kerja menghitung konsentrasi dan kemurnian DNA

menggunakan spektrofotometer
Pengukuran konsentrasi DNA melalui spektofotometer dengan hasil
pemurnian (purifikasi) antara 1, 3-8, 3 nm dan konsentrasi yang dapat terukur
berkisar antara 0,2-162, 35 nm, melalui pengenceran 10 kali dari jumlah
sampel. Ukuran molekul DNA yang termaat kecil hingga tidah dapat dilihat
dengan kast mata. Namun demikian ukuran (panjang- pendek ),
kuantitas(jumlah ) DNA yang berhasil dimurnikan/ purifikasi dan kualitas
tingkat purifikasi (kemurnian) molekul DNA dapat diketahui dengan
 pendugaan yang cukup akurat. Pengukuran kuantitas dan kualitas DNA dapat
diduga melalui spektofotometri sinar ultra violet, dengan bantuan alat
spektoforometer DU 650.
Iradasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein
dalam larutan memungkinkan terbaca dan terukurnya konsentrasi molekul
DNA,penyerapan sinar oleh nukleotida terhadap molekul DNA secara
maksimal oleh protein mencapai panjang gelombang 280 nm
Kemurnian (purifiksasi) DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi
protein dalam larutan ,molekul DNA yang telah terukur dapar diketahui
mencapai nilai standar yang berkisar antara 1,8-2,0 nm. Jika nilai tersebut
lebih kecil dari 1,8 nm maka dapat terindikasi mengalami kontaminasi
protein ,alkohol ,atau fenol dalam larutan, kesulitan didalam menemukan dan
mengukur kemurnian , serta konsentrasi DNA ini karena DNA yang berada
dalam tabung Eppendorf tersebut menyebar atau berada hanya satu titik saja.
Setelah melalui pengukuran spektofotometer ini tidak dapat ditemukan secara
tepat dan akurat dan sering pula mengalami pengulangan dalam pengukuran
kemurnian atau konsentrasi tersebut ( Nayasilana dkk, 2010 ).
Secara kualitas DNA dilihat dengan menggunakan spektofotometer
kemudian dihitung nilai kemurnian dan konsentrasinya dengan menggunakan
rumus:

Konsentrasi ( C ) = [ Absorbansi pada λ A260 x Faktor C]

(|pada| λ A 260−|pada| λ A 320)
Rasio kemurnian DNA = ¿
(|pada| λ A 280−|pada| λ A 320)

Keterangan : Faktor C = 50 µg/ml ( konversi unit dari DNA untai

ganda) (Mulyani dkk, 2020).

3. Prosedur kerja PCR

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40
siklus dan berlangsung dengan cepat :
a. Denaturasi
Di dalam proses PCR,denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerasi ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
 merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai
tunggal. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi
aktifitas enzim taq polymerase,aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu
paruh lebih dari 2 jam,40 menit,5menit masing-masing pada suhu 92,5:95
dan 97ºC
b. Annealing(penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18-25 basa,mengandung 50-60
% G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Waktu annealing
yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30-45 detik,semakin panjang
ukuran primer,semakin tinggi temperaturnya,kisaran temperature
penempelan yang digunakan adalah antara 36ºC sampai dengan 72ºC
namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50-60ºC.
c. Pemanjangan primer(Extention)
Selama tahap ini taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim
tersebut pada suhu 72ºC diperkirakan 35-100 nukleotida/detik,bergantung
pada buffer,pH,konsentrasi garam dan molekul DNA target. Waktu 1
menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer
ini,biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini di
perpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan
terbentuk DNA untai ganda (Yusuf,2010).
d. Pembuatan PCR Mix
Diambil masing-masing 10µL primer FSHR forward dan revarse dan
dimasukkan kedalam tabung effendorf steril. Kemudian sebanyak 100 µL
GoTaq masterMix green dimasukkan kedalam tabung efendorf sterill dan
dicampurkan dengan primer serta ditambahkan H2O sebanyak 90µL.
e. Deteksi amplifikasi DNA dengan metode PCR
Tabung PCR yang berisi PCR Mix dan DNA dimasukkan kedalam
mesin thermal cycler verity applied biosystem. Setelah itu mesin thermal
clyer dijalankan dengan kondisi PCR:predenaturasi 95ºC selama 2 menit
sebanyak 1 siklus,denaturasi 94ºC selama 1 menit,annealing 58ºC selama
45 detik,extension 72ºC selama 45 detik, post extensi 72ºC selama 5 menit
 sebanyak 34 siklus.Selanjutnya hasil PCR gen FSHR dielektroforesis
untuk melihat band hasil amplifikasi.

4. Deteksi produk PCR dengan elektroforesis

Gel agarosa 2% yang telah dibuat dimasukkan ke dalam erlenmeyer
yang telah berisi TAE buffer 0,5x sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan ke
dalam microwave selama 2 menit hingga mendidih, lalu ditambahkan 8µL
ethidium bromida. Cairan gel lalu didinginkan pada suhu kamar. Setelah agak
dingin, caran gel dituang ke cetakan gel elektorforesis dengan menggunakan
sisir gel dengan jumlah sisir 17 sumur. Diambil 2 µL loading dye dan
dicampurkan ke dalam 5 µL PCR produk setiap sampel, selanjutnya
dimasukkan kedalam sumur yang ada pada gel agarose. Diambil 5 µl ladder
100 bp dan dimasukkan dalam sumur paling ujung dari gel agarose.
Selanjutnya power suply dinyalakan dengan pengaturan 100 volt selama 50
menit. Setelah 50 menit elektroforesis dihentikan dan gel agarose diangkat
untuk diamati dibawah sinar UV dan dimasukkan dalam gel documentation
untuk melihat band hasil amplifikasi gen FSHR sebesar 520 bp. Hasil positif
jika terdapat pita DNA yang sejajar dengan marker 520bp dan negative jika
tidak terdpat pita pada gel (Sjafaraenan dkk,2018).

5. Step 5
untuk mengetahui pemeriksaan secara mikroskopis dengan bahan pemeriksaan
secara mikroskopis dengan bahan pemeriksaan berupa sediaan apus darah. Dalam
beberapa pemeriksaan tersebut mahasiswa mengalami kendala untuk mengetahui
prosedur kerja dari estraksi dan pemurnian menggunakan spektrofotometer.

6. Step 6

Belajar Mandiri.

7. Step 7

Presentasi dan paparan mahasiswa

 Pembagian Kelompok Tutorial
Bakteriologi 1 TK 2 Semester 3

No Nama Mahasiswa NIM Dosen Tutor

1 Ade Kurnia 51120001

2 Alfa OKtavia 51120002
3 Arifa Al Husnah 51120003
4 Aziyo Kurniawan 51120004
5 Afaizah Rahmadhani 51120005
6 Faranisa Dzullya Syafitri 51120006
Nurhidayanti, M.Kes
7 Feronica Putri Pratama 51120007
8 Firna kamilatun nuha 51120008
9 Friska novitasari 51120009
10 Handrian mahendra 51120010
11 Heni resinta agustin 51120011
12 Intan putri permmata 51120012
13 Jefri ardiansyah 51120013
14 Meilisa Dwi sella 51120014
15 Nabila Margareta putri 51120015
16 Neci ecin 51120016
17 nurhaliza 51120017
18 Nurul pathiyah 51120018 Indah Sari, M.Si
19 Putri utami 51120019
20 Rosilawati 51120020
21 Suci romadhona 51120021
22 Umi Kalsum 51120022
23 Destiana rua syahfitri 51121029