LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI-PARASITOLOGI

Oleh :
Abdillah Choirul Chisholi G2A022003
Dosen pengampu: Dr. Tri Ramadhani, SKM, M.Sc

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

FAKULTAS KEDOKTERAN ILMU BIOMEDIS
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
2022
 PRAKTIKUM
IDENTIFIKASI PLASMODIUM DAN FILARIASIS SECARA MIKROSKOPIS
DAN PCR SAMPEL DARAH MANUSIA

A. Pendahuluan
Plasmodium dan filaria merupakan penyakit yang ditularkan oleh vektor nyamuk.
Plasmodium merupakan parasit penyebab malaria, Malaria merupakan masalah
kesehatan masyarakat yang dapat menyebabkan kematian terutama pada kelompok
risiko tinggi, yaitu bayi, anak balita dan ibu hamil. Selain itu malaria secara
langsung menyebabkan anemia dan dapat menurunkan produktivitas kerja. Saat ini
terdapat lima spesies Plasmodium yang dapat menginfeksi manusia, yaitu
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium
malariae.

Penyakit ini menyebar melalui tusukan nyamuk. Ketika nyamuk menghisap

seseorang/hewan yang menderita filariasis maka mikrofilaria yang bersirkulasi
dalam darah masuk dan menginfeksi nyamuk. Ketika nyamuk yang terinfeksi
menusuk orang lain, mikrofilaria akan masuk kedalam aliran darah melalui tusukan
nyamuk lalu menuju ke pembuluh getah bening. Di pembuluh getah bening
mikrofilaria tumbuh menjadi dewasa. Cacing dewasa hidup sekitar 5- 7 tahun.
Cacing dewasa kawin dan melepaskan jutaan mikrofilaria, kedalam darah. Orang
yang terinfeksi filaria dapat memberikan infeksi kepada orang lain melalui nyamuk
(CDC, 2018).

Cara filaria menginfeksi manusia yaitu melalui gigitan vektor Antropoda, misalnya
nyamuk. Vektor ini menjadi infeksi karena menelan mikrofilaria yang berada dalam
darah mamalia. Setiap spesies filaria mempunyai pola daur hidup yang kompleks.
Infeksi pada manusia terjadi apabila terkena pemaparan larva infeksi secara intensif
dalam jangka waktu lama. Setelah pemaparan, diperlukan waktu bertahun-tahun
untuk terjadinya perubahan patologis nyata pada manusia (Onggowaluyo, 2002).

Diagnosa penyakit filariasis dilakukan dengan pemeriksaan mikrofilaria.

Pemeriksaan mikrofilaria merupakan pemeriksaan menggunakan apusan
darah/sediaan darah dengan bantuan pewarnaan Giemsa untuk mendeteksi
mikrofilaria/cacing mikrofilaria tersebut dalam sel darah penderita yang diambil
pada malam hari. Indikasi pemeriksaan mikrofilaria yaitu untuk membantu
 menegakkan diagnosis penyakit filariasis/kaki gajah (Onggowaluyo, 2002).

Diagnosis molekuler merupakan metode diagnosis yang bertujuan untuk memahami

mekanisme molekuler suatu penyakit pada setiap individu pasien. Pemeriksaan
menggunakan metode berbasis molekuler adalah teknik yang dapat digunakan
untuk mendeteksi parasit melalui urutan basa nitrogen (DNA) suatu parasit dengan
menggunakan reaksi rantai polymerase (Polymerase Chain Raction/PCR).

Pemeriksaan PCR konvensional dan Real Time PCR sudah dikembangkan untuk
diagnosis molekular dari infeksi plasmodium. Pemeriksaan dengan PCR dapat
mendeteksi DNA dari plasmodium pada darah manusia dan vektor nyamuk dengan
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi.

B. Alat dan Bahan

1. Kapas alkohol 11. Giemsa 21. Wash buffer
2. Lancet 12. PCR konveksional 22. Elution buffer
3. Autoclik 13. Elektroforesis 23. GD column
4. Slide glass 14. Tabung kapiler 24. Waterbath
5. Pipet tetes 15. Blue tip dan white tip 25. Vortex
6. Mikrotube 16. Neraca analitik 26. Larutan TBE
7. Mikropipet 17. larutan TBE
8. Sentrifius 18. Larutan RBC buffer lisis
9. Darah kapiler 19. GB buffer
10. Mikroskop 20. W1 buffer
C. Cara Kerja Pemeriksaan Plasmoidum Secara Mikroskopis
1. Usap bagian permukaan yang akan diambil darahnya dengan kapas beralkohol
70 %.
2. Tusuk dengan blood lancet, tetes darah yang pertama dihapus lagi dengan kapas.
3. Ambil tetes darah yang kedua pada objek gelas bersih.
 4. Ambil objek gelas yang lain, lalu salah satu bagian tepi objek gelas tersebut
ditempelkan pada tetes darah di atas (no. 3), diamkan sehingga darah
melebar sepanjang tepi objek gelas tadi.

5. Geserkan dengan objek gelas dengan sudur 45 derajat sepanjang permukaan

objek gelas sehingga terbentuk lapisan darah tipis.

6. Preparat dibiarkan kering.

7. Sediaan darah tipis difiksasi dengan metanol selama 3 - 5 menit.

8. Warnai dengan larutan giemsa 3% selama 45-60 menit.

9. Preaprat dicuci dengan air kran/ air mengalir secara perlahan.

10. Preparat dikeringkan.

11. Periksa dibawah mikroskop (pembesaran 10x100).

D. Cara Kerja Pemeriksaan Filariasis Secara Mikroskopis

1. Usap bagian permukaan yang akan diambil darahnya dengan kapas beralkohol
70 %.

2. Tusuk dengan blood lancet, tetes darah yang pertama dihapus lagi dengan
kapas.

3. Ambil darah menggunakan tabung kapiler sebanyak 60 µl.

4. Teteskan pada slide glass dengan dengan membentuk tiga garis sejajar
sepanjang slide.

5. Preparat dikeringkan diudara terbuka.

6. Preparat dicuci menggunakan aquades, sampai warna merah darah pudar.

7. Fiksasi preparat menggunakan metanol 3-5 menit.

8. Warnai dengan larutan giemsa selama 45-60 menit.

9. Preaprat dicuci dengan air kran/ air mengalir secara perlahan.

10. Preparat dikeringkan.

11. Periksa dibawah mikroskop (pembesaran 10x100).

E. Cara Kerja Pemeriksaan Plasmodium Dan Filaria Menggunakan PCR

a. Persiapan sampel
1) Pipet 300 µl darah segar kedalam mikrotube.
 2) Tambahkan RBC lisis buffer sebanyak 3X volume sampel, campurkan darah
dengan buffer lisis, jangan menggunakan vortex.
3) Inkubasi tube selama 10 menit di suhu ruang.
4) Sentrifius selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm, kemudia buang
supernatannya.
5) Tambahkan 100 µl RBC buffer lisis, resuspend pelet dengan larutan buffer
lisis menggunakan mikropipet.
6) Tambahkan 200 µl GB buffer kemudian homogenkan menggunakan vortex.
7) Inkubasi pada 60°C selama 10 menit, selama inkubasi balikkan tabung
setiap 3 menit.
8) Setelah inkubasi, tambahkan 200 µl etanol absolut, campurkan
menggunakan vortex. Tempatkan pada GD column dalam collection 2 ml
9) GD column di sentrifius pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit, buang
collection kemudian ganti dengan collection yang baru.
10) Tambahkan 400 µl W1 buffer ke GD column setelah itu sentrifius pada
kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik, buang collection kemudian ganti
dengan collection yang baru.
11) Tambahkan 600 µl wash buffer, kemudian sentrifius pada 14.000 rpm
sealama 30 detik. Tempatkan kembali ke GD column kedalam collection
yang baru.
12) Sentrifius lagi selama 3 menit pada 14.000 rpm untuk mengeringkan matriks
kolom.
13) Column yang sudah di kering, kemudian di masukam kedalam mikrotube
1,5ml yang bersih.
14) Tambahkan 100 µl elution buffer, kemudian sentrifius pada 14.000 rpm
selama 30 detik untuk mengelusi DNA yang dimurnikan.
15) DNA yang murni siap di periksa.
b. Pembuatan campuran reaksi
1. Pipet 2X green master mix sebanyak 12.5 µl masukan kemikrotube.
2. Pipet primer R sebanyak 1 µl campurkan kemikrotube.
3. Pipet primer F sebanyak 1 µl.
4. Pipet nuclease free water sebanyak 5,5 µl, campurkan menggunakan vortex.
5. Tambahkan DNA template sebanyak 5 µl.
c. Proses amplikasi PCR
1. Masukan campuran reaksi kedalam alat PCR.
2. Alat akan memproses denaturation, annealing dan extension.
d. Elektroforesis DNA
1) Letakkan pencetak sumur pada cetakan gel.
2) Pembuatan Gel: -
• Untuk DNA yang sudah di PCR: agarose 2% sebanyak 0,8 gram +
Pelarut aquades sebanyak 40 ml.
• panaskan selama 5 menit mengggukan oven
3) Tuangkan ke dalam cetakan gel yang sudah di pasang pencetak sumur
4) Diamkan sampai gel mengeras.
5) Letakkan cetakan gel pada alat elektroforesis, tuang bufer TBE hingga
mencapai tinggi 1 mm diatas gel.
6) Masukan campuran DNA, marker , dan kontrol positif kedalam sumuran
sebanyak 2,5 µl.
7) Hubungkan alat elektroforesis dengan sumber arus dan nyalakan sumber
arus pada70 Volt sampai campuran DNA biru mencapai ujung gel (kurang
lebih 35 menit).
8) Matikan sumber arus.
9) Keluarkan gel dari tangki gel. Dilihat di ruang gelap dengan cahaya UV.
10) Amati dan dokumentasikan hasil pengamatan.
A. Hasil Pemeriksaan
1. Hasil pemeriksaan plasmodium dan filariasis secara mikroskopis
 2. Hasil pemeriksaan plasmodium dan filariasis secara PCR

B. Pembahasan
Pada pemeriksaan mikroskopis di dapatkan plasmodium falcifarum, plasmodium
vivax dan plasmodium malarie. Pemeriksaan mikroskopis filaria di dapatkan
Wuchereria bancrofti, Brugia malayi. Pemeriksaan metode PCR diperoleh hasil DNA
filaria 1100BP untuk sampel no 2 memiliki nilai marker yang sama dengan kontrol
positif.
Metode mikroskopis untuk deteksi malaria tidak terdapat infeksi campuran dan
tidak terdapat kesalahan interpretasi spesies berdasarkan pengecatan Giemsa karena
morfologi spesies p. falcifarum dan p.vivax ini memang khas dan dapat dibedakan
secara mudah melalui pengamatan di bawah mikroskop. Metode PCR sangat sensitif
dan spesifik dalam penegakan diagnosis malaria dan mampu mengidentifikasi spesies
parasit secara akurat, namun sedian darah tipis masih tetap menjadi gold standart
dalam mendiagnosa malaria.
Untuk mendeteksi filaria metode PCR mempunyai sensitiivitas dan negative
predictive value yang sangat tinggi terhadap pemeriksaan mikroskopik. Oleh karena
itu metode ini lebih tepat digunakan untuk mengevaluasi keberhasilan pada program
eliminasi filariasis limfatik, terutama dalam membantu mengevaluasi pasca
pengobatan filariasi limfatik. Setelah dilakukan pengobatan filariasis, tampak adanya
kecenderungan densitas mikrofilaria yang semakin rendah. Keadaan semacam ini
menyebabkan tidak terdeteksinya mikrofilaria di dalam darah tepi dengan
pemeriksaan mikroskopik sehingga ditakutkan terjadi negatif palsu. Jika terjadi
negatif palsu maka tujuan eliminasi filariasis tidak akan tercapai karena transmisi
penyakit masih bisa terjadi.