A.

Latar Belakang
Penyakit malaria adalah suatu penyakit menular yang banyak diderita oleh penduduk di
daerah tropis dan subtropis. Malaria merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh protozoa
dari genus plasmodium yang ditularkan melalui gigitan nyamuk anopheles betina. Malaria adalah
penyakit infeksi yang disebabkan oleh protozoa dari genus Plasmodium yang ditularkan melalui
gigitan nyamuk Anopheles betina. Malaria pada manusia dapat disebabkan oleh Plasmodium
falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium ovale (P. ovale),
Plasmodium malariae (P. malariae) dan Plasmodium knowlesi (P. knowlesi). Parasit yang terakhir
disebutkan ini belum banyak dilaporkan di Indonesia (Kemenkes, 2012).
Penyakit malaria masih menjadi salah satu masalah kesehatan masyarakat di Indonesia yang
penyebarannya cukup luas di Indonesia terutama di daerah Indonesia bagian timur. Banyak faktor
yang menyebabkan terjadinya penularan penyakit malaria, antara lain pertumbuhan dan
pengembangan wilaya sejalan dengan peningkatan pertumbuhan penduduk; kepadatan penduduk
dan kecenderungan migrasi penduduk dari daerah non edemis ke daerah edemis malaria untuk
mencari pekerjaan dan penghidupan yang lebih layak; mengakibatkan rusaknya wilaya ekologi
dan lingkungan sehingga menyebabkan timbulnya tempat perkrmbangbiakan nyamuk malaria
Kepentingan untuk mendapatkan diagnosis yang cepat pada penderita yang di duga
menderita malaria merupakan tantangan untuk mendapatkan uji metode laboratorik yang tepat,
cepat, sensitif, mudah dilakukan, serta ekonomis. Pemeriksaan laboratorium untuk menegakkan
diagnosa penyakit malaria dapat dilakukan dengan berbagai metode. Salah satu metode yang
digunakan untuk menemukan jenis dan stadium dari parasit penyebab malaria adalah sediaan darah
malaria.
Metode standar diagnosis malaria berdasarkan pada hasil pembacaan sediaan darah tipis dan
sediaan darah tebal menggunakan mikroskop setelah sediaan darah diwarnai menggunakan larutan
Giemsa dengan menggunakan konsentrasi tertentu. Kemampuan seorang analis baik dalam
membuat sediaan darah, mewarnai dan memeriksanya sangat menentukan ditemukannya parasit
malaria. (Depkes, 1999)

B. Rumusan Masalah
Bagaimanakah prosedur dalam pemeriksaan Malaria dengan menggunakan metode sediaan
darah tipis?

C. Tujuan
1. Untuk mengetahui cara mendeteksi dan mengidentifikasi parasit malaria serta
menentukan spesies plasmodiun secara mikroskopis.
2. Untuk mengetahui pemeriksaan malaria dengan menggunakan sediaan darah tipis.
D. Prosedur Pemeriksaan
Pra-Analitik
A. Pengambilan Sampel
Pada pemeriksaan malaria digunakan sampel berupa darah. Darah yang dapat digunakan
untuk diagnosis dapat darah perifer maupun darah vena. Darah perifer diambil
menggunakan blood lancet apalagi akan langsung dibuat sediaan hapusan darah,
sedangkan darah vena diperlukan apabila pembuatan sediaan darah dalam jumlah cukup
banyak dan berulang. EDTA dapat dipakai sebagai antikoagulan karena tidak berpengaruh
terhadap morfologi eritrosit dan lekosit serta mencegah trombosit bergumpal. Pemeriksaan
sebaiknya dilakukan dalam waktu kurang dari 2 jam. Tiap 1 ul EDTA digunakan untuk 1
ml darah vena
B. Persiapan Reagen
1. Larutan Giemsa
Larutan giemsa harus dibuat pada saat akan digunakan untuk pengecatan sediaan, tidak
diperbolehkan menggunakan larutan giemsa yang telah dibuat sehari sebelumnya.
Pengenceran larutan giemsa dengan konsentrasi 5% yaitu perbandingan antara giemsa
dan buffer adalah 1:20, 1 bagian giemsa dan 19 bagian buffer. Sedangkan larutan
giemsa 10% memiliki perbandingan 1:10, dan larutan giemsa 20% memiliki
perbandingan 1:5.
Cara pengencerannya larutan giemsa 5%:

 Dipipet buffer kedalam gelas ukur sebanyak 19 mL kemudian ditambahkan

geimsa sebanyak 1 mL
 Lakukan pewarnaan giemsa 5% waktu pendiaman adalah 30 – 45 menit

Catatan :

Buffer yang digunakan dalam pembuatan larutan giemsa biasanya adalah buffer
phospat dengan pH 6,4. Namun dilaboratorium \yang masih minim dalam ketersediaan
bahan atau reagen kerja dapat mengganti buffer dengan menggunakan Aquades
dengan pH yang netral. Perubahan pH dalam larutan giemsa dapat mempengaruhi hasil
pengamatan morfologi sel darah, contohnya jika pada pH yang kurang dari 6,0
morfologi lekosit akan memperlihatkan inti yang kurang jelas.
Pembuatan buffer (PBS)
Bahan:
NaCl 80 gr
KCl 2 gr
Na2HPO4 14,4 gr
KH2PO4 2,4
Aquabides 1L
 - Campurkan seluruh bahan tersebut dalam aquabides 800 ml
- Tambahkan HCl setetes demi setets sampai pH larutan mencapai 7,4
- Tambahkan aquabides sampai sampai volume 1 liter

2. Methanol
3. Air kran
B. Pembuatan sedian hapusan darah
1. Membuat sediaan darah tebal
1. Disiapkan object glass yang bersih dan kering.
2. Dilakukan sampling vena.
3. Diteteskan 200 µl pada object glass.
4. Diratakan melingkar dengan salah satu ujung cover glass.
5. Ditunggu sampai kering.
6. Kemudian dilisiskan dengan air sampai warna putih susu.
7. Dikeringkan kemudian dicat dengan giemsa.
- Digenangi dengan cat giemsa selama 30-45 menit (sesuaikan konsentrasi
giemsa)
- Sediaan dicuci dengan air kran dengan cara meniriskan air kran menggunakan
tangan, kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop.
2. Membuat hapusan darah tipis
1. Disiapkan object glass yang bersih dan kering.
2. Diteteskan 50 µl pada salah satu ujung obyek glass.
3. Dengan cover glass darah dibuat apusan darah yang tipis (cover glass dimiringkan
dengan membentuk sudut 30⁰ C dan kemudian darah digeser dengan cepat sehingga
membentuk hapusan yang tipis dan merata).
4. Sediaan dikeringkan dan kemudian dicat dengan giemsa.
- Sediaan ditetesi dengan methanol selama 1-2 menit.
- Digenangi dengan cat giemsa selama 30 - 45 menit (sesuaikan dengan
konsentrasi giemsa).
- Sediaan dicuci dengan air kran yang ditiriskan menggunakan tangan perlahan,
kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop.

Analitik
Prosedur pemeriksaan sediaan hapusan darah tebal dan tipis secara mikroskopis dengan
pembesaran 100x. Identifikasi keberadaan parasit malaria di dalam RBC pada sediaan
darah tipis dan berada diluar sel pada sediaan darah tebal. Lakukan penghitungan
menyeluruh pada sediaan sampai dipastikan bahwa sampel negatif. Pada sediaan yang
terdapat parasit malaria, hitunglah derajat parasitemia.

Penghitungan parasitemia pada hapusan darah tebal

 Kualitatif

Pengitungan secara kualitatif dilaporkan dengan kode negatif dan positif mengikuti
kategori berikut:
Negatif (-) : tidak ditemukan parasit dalam 100 lapang pandang
Positif satu (+) : ditemukan 1 – 10 parasit dalam 100 lapang pandang
Positif dua (++) : ditemukan 11 – 100 parasit dalam 100 lapang pandang
Positif tiga (+++) : ditemukan 1 – 10 parasit dalam 1 lapang pandang
Positif empat (++++) : ditemukan 11 – 100 parasit dalam 1 lapang pandang

Kuantitatif

- Dihitung per 200 leukosit atau 500 leukosit apabila pada penghitungan 200
leukosit belum ditemukan parasit.
- Jumlah parasit yang ditemukan/200 leukosit dikalikan 40.
- Jumlah parasit yang ditemukan/500 leukosit dikalikan 16
- Hitung jumlah parasit per-µl dengan rumus berikut.
- = Jumlah leukosit dalam 1 µl x jumlah parasit dalam 200 lp
200 leukosit

 Jumlah leukosit : 8000

Sediaan Darah Tipis

Sediaan Darah Tipis (thin smear)
– Identifikasi spesies plasmodium
– Hasil negatif ditentukan berdasarkan Pengamatan yang dilakukan pada 100 lapang
pandang (minimal), jika hasil negatif maka di amati pada 500 lapang pandang
- Penghitungan parasit per 1000 RBC
- Contoh. dtemukan 65parasit/1000RBC
parasitemia = jumlah parasit / 1000 RBC x 100%
= 65/1000 x 100%
= 6,5%
Bila jumlah RBC/ µl =5000000
Maka jumlah parasit/mL = 65 x 5000000
 = 325000000/µl

Pasca Analitik
Pencatatan hasil penghitungan parasitemia

Keterangan:
Species Plasmodium: Plasmodium Malariae

Stadium : Merozoid

Jumlah/lp : 110

Derajat Parasitemia

Sediaan Darah Tebal Kualitatif ++++

Sediaan Darah Tebal Kuantitatif 50.000.000

Sediaan Darah Tipis Kuantitatif

CATATAN :
 Malaria adalah suatu penyakit menular yang disebabkan oleh parasit darah dari filum
protozoa, klas sporozoa, subklas plasmodidae, genus plasmodium dan ditularkan oleh
gigitan nyamuk anopheles betina yang terkena infeksi.
 Macamnya pemeriksaan malaria yaitu:
1. Sediaan tetes darah tebal (screening test)
Darah yang digunakan : darah segar tanpa antikoagulant (darah kapiler).
Tujuan : untuk mengetahui ada tidaknya parasit malaria pada penderita.
Laporan : + (positif) / - (negatif)
Keuntungan :

- Pemeriksaan lebih cepat.

- Pemeriksaan sederhana.
- Parasit mudah untuk ditemukan, apabila dalam darah hanya ada sedikit parasit.

Kerugian :

- Tidak dapat untuk menentukan jenis spesiesnya.

Syarat-syarat sediaan tetes darah tebal :

- Darah / eritrosit harus lisis.
- Tidak boleh dikeringkan di bawah lampu.
- Tidak boleh ada kotoran cat yang menempel pada sediaan.

2. Sediaan darah tipis / apusan darah

Keuntungan :

- Dapat menentukan jenis spesiesnya.

- Darah yang diperlukan sedikit.
- Mudah dalam pemeriksaan (bentuk tropozoit).
Kerugian :

- Karena volume darah sedikit jarang ditemukan bentuk / stadium dari gametosit dan
schizont.
Syarat-syarat sediaan tetes darah tipis / apusan darah :
 - Penyebaran sel eritrosit merata.
- Ada bagian tipis dan tebal.
- Sediaan tidak boleh berlubang-lubang atau ada lemak.

E. Pembahasan
1. Pemeriksaan darah malaria dengan mikroskopis
a. Pengambilan darah kapiler

1) Alat dan bahan

2) Kapas alkohol 70%
3) Objek glass
4) Box Slide
5) Pensil (untuk memberikan label pada slide)
6) Lanset steril untuk mengambil darah kapiler
b. Penyiapan kaca sediaan
1) Kaca sediaan harus bersih, tidak berdebu, tidak berlemak, tidak mengandung alkohol,
jernih tidak kusam, ketebaan 1,1-1,3 mm.
2) Kaca sediaan yang baru, dapat dicuci dengan sabun cair.
3) Dikeringkan dan diberi label.
c. Pengambilan dan pembuatan sediaan darah kapiler
1) Tulis : nomor subjek, inisial nama, tanggal dan hari kunjungan pada slide
2) Pegang jari manis tangan kiri pasien, bersihkan ujung jari tersebut dengan kapas
alkohol, gosok sampai bersih dan keringkan dengan kapas kering.
3) Dengan menggunakan lanset, tusuk ujung jari dibagian pinggir (kulit lebih tipis)
dengan cepat.
4) Bersihkan tetes darah pertama dengan kapas kering.
5) Ambil slide yang sudah diberi label dan teteskan darah sebanyak 3 tetes untuk sediaan
darah tebal (<6µl) dan 1 tetes kecil untuk sediaan darah tipis (<2µl).
6) Gunakan slide bersih sebagai pendorong untuk membuat hapusan darah tipis dan untuk
mengaduk 3 tetes darah tebal.
7) Letakkan slide diatas permukaan yang rata dan kering. Biarkan darah kering diudara
(untuk mempercepat boleh digunakan kipas angin, tidak dengan api atau dijemur
dibawah sinar matahari). Lindunggi slide yang sudah kering dari lalat dan debu.
2. Pewarnaan slide untuk mikroskopis malaria
a. Alat dan bahan
1) Rak pewarnaan
2) Pipet
3) Giemsa stock
4) Metanol absolut
5) Air mineral pH 7,2
b. Langkah-langkah fiksasi dan pewarnaan.
1) Pastikan sediaan telah kering dengan sempurna.
2) Sediaan darah tipis harus difiksasi dengan methanol absolut terlebih dahulu sebelum
diwarnai. Posisi slide agak miring saat meneteskan methanol atau slide dicelupkan
dalam methanol sebentar saja (1-2 detik) dengan posisi darah tipis dibawah, karena
methanol tidak boleh mengenai darah tebal (mengganggu dehemoglobinisasi sediaan
darah tebal)
3) Biarkan darah tipis kering dari methanol ±1 menit.
4) Siapkan cairan Giemsa yang telah dibuat dengan pengenceran 3%.
5) Letakkan slide di rak pewarnaan dan teteskan cairan Giemsa menggunakan pipet sampai
seluruh sediaan darah tergenangi cat.
6) Didiamkan selama 45-60 menit.
7) Bilas perlahan dan hati-hati dengan air bersih.
8) Biarkan slide menggering dengan posisi berdiri.
c. Pembuatan campuran untuk pembuatan giemsa
Pengenceran yang digunakan yaitu 3% yaitu 0,3 ml stock giemsa tambahkan dengan
9,7 ml aquadest, dan dapat digunakan selama 1 jam.
d. Pembacaan slide malaria
1) Alat dan bahan
a) Mikroskop dengan pembesaran objektif 100x dan lensa okuler 10x
b) Minyak imersi
c) Alat hitung parasit
d) Tissue
2) Pembacaan sediaan darah
a) Darah tebal untuk menghitung parasit minimal per 200 lekosit, bila ditemukan parasit
kurang dari 10 darah dalam 200 lekosit maka dihitung per 500 leukosit.
b) Darah tipis untuk konfirmasi diagnosa spesies atau untuk mendapat gambaran
mengenai morfologi parasit. Darah tipis juga digunakan untuk menghitung parasit
minimal dalam 100 eritrosit.
c) Parasit seksual / gametosit dihitung dalam 2000 leukosit.
d) Selesai membaca slide diletakkan terbalik pada tissue, agar minyak imersi terserap
tissue. Slide dapat disimpan pada box slide.
3. Cara perhitungan
Jumlah parasit x 5000 (leukosit) = parasit/µl darah
200 leukosit
Jumlah parasit x 5000 (leukosit) = parasit/ul darah
500 Leukosit
Jumlah gametsit x 5000 (leukosit) = parasit/µl darah
2000 leukosit

Jika menghitung dari hapusan darah tipis

Jumlah parasit x 4,5 juta(eritrosit) = parasit/µl darah
1000 erytrosit

Catatan :
1. Parasit dihitung per 500 leukosit, jika dalam 200 leukosit ditemukan kurang dari 10
parasit.
2. Parasit dihitung pada hapusan darah tipis minimal 1000 erytrosit, jika pada hapusan
darah tebal dalam 200 leukosit ditemukan ≥500 parasit
3. Catat jumlah parasit seksual (gametosit) minimal per 2.000 leukosit.
 F. Hasil
Spesies : Plasmodium Malariae Jumlah RBC : 10
Stadium : Merozoit Jumlah RBC Total : 110
Derajat Parasitemia

Kualitatif : Kuantitatif : jumlah parasit x 100%

1000RBC
= 10 x 100%
1000
=1%
Bila jumlah RBC/µL = 5.000.000

Maka jumlah parasit/ml = 10x5.000.000

= 50.000.000

G. Diskusi
1. Jelaskan penjaminan mutu pada pemeriksaan malaria!

JAWAB : Dengan adanya pengkuruan dan pemeriksaan laboratorium akan didapatkan

data ilmiah yg tajam untuk penjaminan pemeriksaan malaria agar menurunkan angka

kesakitan dan kematian malaria.

2. Jelaskan perbedaan morfologi Plasmodium falciparum dan Plasmodium vivax apabila

dilihat dari sediaan apusan darah tipis!

JAWAB : Plasmodium Falciparum penderita dapat mengembangkananemia hemolitik

berat, gagal ginjal, koma, dan kematian. Plasmodium Vivax penderita dapat

mengembangkan anemia dan pecahnya limpa, yang bisa menjadi hidup terancam.

3. Pada pemeriksaan apusan darah tebal, ditemukan Plasmodium falciparum sebanyak 5

parasit pada penghitungan 500 leukosit. Tentukan jumlah parasit dalam 1 µL darah!

JAWAB : 80µL
 4. Pada pemeriksaan apusan darah tipis, ditemukan Plasmodium falciparum sebanyak

38 parasit pada penghitungan 1000 RBC. Tentukan jumlah parasit dalam 1 µL darah!

JAWAB : 1.900.000µL

5. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi buruknya sediaan!

JAWAB : Adanya kotoran pada sediaan.

6. Jelaskan kemungkinan munculnya positif palsu pada pemeriksaan malaria!

JAWAB : Karena adanya faktor manusia, faktor nyamuk, faktor lingkungan, dan faktor

parasit.

7. Sebutkan metode lain dalam menunjang diagnosis malaria!

JAWAB : Diagnosis pasti infeksi malaria dilakukan dengan menemukan parasit dalam

darah yang diperiksa dengan mikroskop. Peranan diagnosis laboratorium terutama untuk

menunjang penanganan klinis.

H. Kesimpulan

Prosedur dalam pemeriksaan malaria yaitu pertama-tama tetesan darah pasien yang

diletakkan di atas objek glass difiksasi dengan methanol absolute dan dibiarkan 1 menit.

Kemudian, diteteskan larutan giemsa 10% atau 20% ditunggu 25 menit jika digunakan

yang 10% dan 15 menit jika 20%. Selanjutnya, dibilias menggunakan air suling dan

dibiarkan hingga kering. Terakhir, diamati preparat tetesan darah tersebut dengan

menggunakan mikroskop.

I. Daftar Pustaka
 P.N. Harijanto (Ed), Agung Nugroho (Ed), dan Carta A. Gunawan (Ed). Malaria dari

molekuk ke klinis.2012.Penerbit: EGC.

J. Dokumentasi Praktikum