ISOLASI DAN INOKULASI

TEKNIK ASEPTIK

Kegiatan sehari –hari di laboratorium Mikrobiologi digolongkan menjadi dua yaitu

kegiatan yang bersifat non aseptik dan kegiatan aseptik , kegiatan membersihkan meja kerja
dengan lap , tanpa menyemprot meja dengan alkohol bukan termasuk kegiatan aseptik,
sedangkan jika area kerja disemprot dengan alkohol, kegiatan ini termasuk tindakan aseptik.

Persiapan sebelum sterilisasi misalnya pembungkusan cawan petri, membuat sumbat,

memipet media tanpa disterilisasi, melarutkan bahan, membuka cawan petri untuk
membersihkan dari debu dengan lap , mencuci tanpa menggunakan sabun, kegiatan ini
bersifat non aseptis. Kegiatan setelah proses sterilisasi, baik itu sterilisasi media, bahan,
peralatan, kegiatan untuk mempertahankan kesterilan ini disebut dengan istilah teknik
aseptik.

Aseptik berarti tidak adanya kontaminan pada sampel mikroba, area kerja dan media
pertumbuhan, sedangkan Teknik Aseptik adalah usaha untuk mencegah adanya kontaminasi
sampel,area kerja dan media dari mikroba kontaminan.

Teknik Aseptik dalam Mikrobiologi dimulai dengan persiapan analis masuk

laboratorium, kegiatan setelah sterilisasi peralatan dan bahan , saat bekerja yang di mulai
dengan pembersihan area kerja, selalu bekerja dekat api untuk mencegah kontaminasi saat
mentransfer mikroba.

A. MEMULAI BEKERJA ASEPTIK

1.Menutup semua pintu, jendela dari aliran udara .

2. Mencuci tangan yang benar

1. Siram tangan anda dengan air mengalir.

2. Pergunakan sabun untuk membersihkan sela jari-jari tangan hingga punggung

tangan sampai seluruhnya terkena air sabun.

3. Bilas kembali dengan air hingga tangan anda terbebas dari sisa sabun

4. Tadahkan tangan dibawah kran air, siramkan air pada gagang kran air sehingga

bersih dari sisa sabun, hal ini untuk menghindarkan karat pada putaran kran air.

3. Membersihkan Area Kerja.

1. Bersihkan area kerja dari benda benda yang tidak diperlukan

2. Semprot meja kerja dengan Akohol,demikian pula udara disekitar area kerja
3. Meja kerja di lap, dengan satu arah ke arah badan ( bawah )

4. Semprot tangan dengan alkohol dan gosokkan ke sela jari hingga merata.
 B. MEMINDAHKAN/MENTRANSFER BAKTERI SECARA ASEPTIK.

B. 1. INOKULASI DAN ISOLASI

Memindahkan bakteri/mikroba dari media lama ke media steril yang baru dalam istilah
mikrobiologi disebut dengan Inokulasi, sedangkan Isolasi adalah memindahkan bakteri dari
media lama ke media baru secara yang bertujuan untuk mendapatkan biakan murni. Istilah ini
seringkali sulit dibedakan sebab keduanya merupakan kegiatan memindahkan bakteri dari satu
media ke media lain , hanya saja tujuannya berbeda, isolasi bertujuan untuk membuat biakan
murni, sedangkan inokulasi bertujuan untuk memindahkan bakteri untuk peremajaan,
penghitungan, atau kegiatan lain yang sifatnya memindahkan mikroba.

Isolasi pada tahap awalnya dapat berupa memindahkan bakteri ( melakukan Inokulasi
) dengan cara mengencerkan sampel, membuat goresan kwadran, T, sinambung atau radian ,
dilanjutkan inokulasi dari koloni terpencil sampai mendapatkan biakan murni, yaitu
mendapatkan kultur bakteri yang hanya satu jenis. Isolasi bisa juga dilakukan langsung dari
kultur campuran kemudian dipindahkan/diinokulasi ke media baru sampai menghasilkan
biakan murni, atau dengan pengenceran dilanjutkan dengan penebaran atau penuangan
media, dengan kata lain isolasi pasti melakukan inokulasi, sedangkan inokulasi tidak selalu
melakukan isolasi.

B.2. BEBERAPA TEKNIK INOKULASI .

Inokulasi adalah memindahkan mikroba dari media lama ke media steril yang baru
secara aseptik, ada beberapa cara memindahkan mikroba yaitu :

1 . PEMINDAHAN DENGAN PIPET .

1.1. Mencampuradukkan mikroba kedalam media cair, dituang ke petri steril.

Untuk menghitung jumlah Mikroba yang ada pada bahan pangan dapat
dilakukan dengan cara mengencerkan sampel dalam pelarut fisiologis ( NaCl 0,85%, =
8,5 gram NaCl dalam 1 liter aquades), sampel yang telah diencerkan tersebut
kemudian di pipet dengan pipet steril ( bisa dengan mikropipet) sebanyak 1 ml untuk
dicampuradukkan ke dalam media yang masih cair ( suhu 45-50 0C ), media yang telah
bercampur dengan sampel ini selanjutnya di tuang dalam cawan steril, diputar hingga
merata atau diputar membentuk angka 8, kemudian didiamkan sampai dingin, di
inkubasikan selama 1X 24 jam atau 2 X 24 jam dalam posisi terbalik, posisi terbalik ini
untuk menghindari tetesan uap yang telah dingin/kondensasi pada tutup cawan akibat
penuangan media yang dapat menyebabkan penyebaran koloni. Koloni Biakan yang
diperoleh dari teknik ini disebut Piaraan adukan.

1.2. Pemindahan mikroba dengan Pipet , dituangi media (Pour Plate)

-6
Sampel diencerkan dengan pengenceran tertentu misalnya 10 , kemudian di
pipet sebanyak 1ml atau 0,1 ml di letakkan pada cawan petri steril yang masih
kosong, dituangi media yang masih cair , di goyang ke kiri-kanan, depan-
belakang atau diputar melingkar atau membentuk angka 8.

1.3. Pemindahan dengan pipet kemudian disebarkan / Teknik Agar Sebar

Langkah awal metode ini sama dengan memindahkan dengan pipet , yaitu
sampel diencerkan hingga pengenceran tertentu, kemudian sampel diambil sebanyak
0,1 ml menggunakan pipet steril/mikropipet, sampel tersebut disebarkan pada media
lempeng yang sudah membeku dengan menggunakan penyebar yang terbuat dari
kaca, kaca penyebar ini sebelum digunakan dicelup/disemprot alkohol, dibakar,
didinginkan ,kemudian digunakan untuk menyebarkan sampel pada permukaan
media,penyebaran ini dilakukan dengan memutar cawan petri yang berisi agar beku
tersebut.
B.3. PEMINDAHAN DENGAN OSE.

Ada beberapa cara dalam memindahkan/menanam bakteri dengan menggunakan ose

yaitu :

3.1. Menggoreskan/streak : ose digoreskan pada permukaan agar dengan gerakan zig-zag

goresan ini dapat dilakukan pada media miring atau media lempeng, sedangkan inokulasi
yang bertujuan untuk membuat kultur murni diawali dengan membuat goresan
goresan kwadran, T, radian dan Sinambung

3.2. Menusuk (stab Culture) : ose ditusukkan pada media tegak yang berada pada tabung

Reaksi sedalam setengah atau mendekati dasar + 1,5 cm dari dasar tabung. Ose yang

digunakan berujung lurus.

3.3. Mengaduk : Ose berkolong (berujung bulat) digunakan untuk mengambil

sampel,inokulum yang didapatkan di masukkan kedalam media cair (broth) ,diaduk-

 aduk sampai inokulum terlepas semua dari Ose.

Gambar inokulasi menggunakan Ose.

Inokulasi pada media cair-semipadat-padat miring

a.mengaduk (cair)

b.menusuk (padat –tegak)

c.menusuk (semi-padat)

d.slant (zig-zag)

C. BEBERAPA TEKNIK ISOLASI BIAKAN MURNI

Mikroba di alam ,tidak ada yang dalam keadaan murni (satu jenis) , Isolasi berarti
menyendirikan mikroba dari kultur campuran untuk dijadikan kultur yang berisi satu jenis.
Untuk membuat kultur murni memerlukan beberapa tahapan, jarang sekali bahkan hampir
tidak pernah membuat kultur murni dari alam satu kali pemindahan langsung menjadi biakan
murni dengan kata lain Isolasi adalah inokulasi yang dilakukan beberapa kali sampai
menghasilkan biakan murni/kultur yang hanya 1 jenis mikroba.

Ada beberapa cara dalam teknik Isolasi (menyendirikan biakan Murni ) yaitu

1.Isolasi dengan cara Penuangan/ Teknik Agar Tuang (Pour plate Method)

2.Isolasi dengan penyebaran / Teknik Agar Sebar (Spread plate method)

3.Isolasi dengan Penggoresan

4.Isolasi dengan Mengucilkan 1 sel ( single cell isolation)

5.Inokulasi Hewan

1. ISOLASI DENGAN PENUANGAN/TEKNIK AGAR TUANG (POUR PLATE METHODE)

Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Robert Koch (1843-1905), sampel
diencerkan hingga pengenceran tertentu/tergantung dari banyaknya mikroba.
Pengenceran dapat dilakukan dengan memipet sampel kemudian diencerkan
bertingkat , diambil 0,1ml, dimasukkan dalam cawan petri kemudian dituangi media
padat yang masih mencair. Pengenceran juga bisa juga dilakukan dengan
menggunakan ose dan tabung reaksi yang berisi agar cair yang belum membeku
dengan kisaran suhu 45-500C dalam penangas , kemudian dituang kedalam petri dan
diinkubasikan pada suhu 370 selama 1 X 24 jam atau 2 X 24 jam. Isolasi dinyatakan
berhasil jika yang didapat hanya 1 koloni yang sejenis.

1.1. Prosedur Teknik Agar Tuang.

A. Pengenceran menggunakan dengan jarum ose.

1. Siapkan sampel biakan campuran di dalam pelarut cair steril.

2 . Siapkan 3 buah tabung reaksi yang berisi masing-masing 15 ml media cair

0
NA dengan kisaran suhu 45-50 C , berilah label A1, A2 dan A3, letakkan

dalam penangas.

2.Siapkan cawan petri steril dan berilah label A1, A2 dan A3

3. Ambilah suspensi sampel dari biakan cair campuran dengan ose dan

masukkan ke tabung reaksi dengan label A1, putar sampai homogen,

kembalikan ke penangas.

4.Dari tabung A1 ambillah 1 mata ose biakan masukkan ke tabung A2 ,

Homogenisasi, letakkan kembali pada penangas, lakukan kembali hingga

tabung A3 berisi satu mata ose dari tabung A2.

 5. Tuangkan isi tabung A3 kedalam petri A3 secara aseptik, putar melingkar

atau membentuk angka 8, diamkan sampai membeku.

6.Dengan cara yang sama lakukan penuangan untuk tabung A1 ke petri A1 dan

tabung A2 ke petri A2.6.

0
Inkubasikan petri secara terbalik pada suhu 37 selama 24-48 jam.

B. Pengenceran dengan pipet.

1.Siapkan sampel berisi media campuran dalam pelarut steril

2. Siapkan 6 tabung reaksi masing masing berisi 9 ml pelarut steril.

-6
3. Dengan pipet ambillah 1 ml sampel encerkan hingga 10

-6
4. Ambil 0,1 ml dari pengenceran 10 ,letakkan pada cawan petri.

5.Tuangi media ,ratakan dengan memutar cawan petri.

0
6. inkubasi pada suhu 37 C ,selama 1X24 dan 2X24 jam

7. jika hasilnya 1 koloni maka isolasi berjalan dengan baik, jika banyak koloni

yang tumbuh ulangi kegiatan ini ,sampel berasal dari hasil kegiatan

sebelumnya.

2. ISOLASI DENGAN PENYEBARAN / TEKNIK AGAR SEBAR (SPREAD PLATE

METHOD)

Sampel yang berupa suspensi campuran berbagai spesies diencerkan,dengan

cara memipet 1 ml dimasukkan kedalam pelarut 9 ml maka akan diperoleh sampel
dengan pengenceran 10-1 , dari pengenceran ini diambil kembali 1 ml dimasukkan pada
-2
tabung reaksi berisi 9 ml , maka akan didapat pengenceran 10 , dengan cara yang
-3
sama diencerkan lebih lanjut sehingga mendapat pengenceran 10 , dan seterusnya.
Dari yang pengenceran tertinggi (sesuai kebutuhan), di ambil 0,1 ml untuk disebarkan
pada media lempeng padat, Penyebaran dilakukan dengan alat penyebar yang terbuat
dari kaca yang disterilkan dengan dicelup kedalam alkohol kemudian dibakar ,dari
Penyebaran hal ini kemungkinan akan mendapat beberapa jenis koloni bakteri, akan
tetapi mungkin juga akan mendapat satu koloni saja, jika hanya mendapat satu koloni
maka kita telah memperoleh satu koloni biakan murni. Apabila kita tidak yakin dengan
kemurnian koloni ini maka dapat mengulang teknik pengenceran ini dengan sampel
koloni tunggal yang telah kita dapatkan. Metode isolasi Biakan murni ini pertama kali
dilakukan Oleh Lister pada tahun 1865 ,yang telah berhasil mendapatkan biakan murni
Streptococcus lactis dari air susu masam.

METODE TUANG DAN METODE SEBAR

Perbedaan antara metode tuang dan metode Sebar.

a. Metode tuang ; pipet sampel 0,1 atau 1 ml, letakkan ke petri , tuangi media yang
masih cair .

b. Metode sebar ; pipet sampel 0,1 ml ,letakkan pada media lempeng, sebar dengan
batang peyebar.
3. ISOLASI DENGAN TEKNIK PENGGORESAN

1.Isolasi dengan Pemindahan dengan teknik penggoresan memerlukan ketrampilan

yang diperoleh dari latihan menggoreskan ose pada media agar, kelemahan dari

teknik ini adalah bakteri anaerob (yang tidak memerlukan oksigen) tidak dapat

tumbuh.

Ada beberapa Teknik penggoresan yaitu ;

A. Goresan T

1.Siapkan media lempeng Steril

2. Pada dasar cawan dibagi menjadi 3 daerah dengan menuliskan huruf T .

3. Pijarkan ose berkolong, dinginkan, kemudian ambillah sampel .

4. Ambillah cawan petri yang telah diberi tanda huruf T ,putarlah bagian tepi

menyentuh api bunsen, kemudian cawan dibuka pada bagian atas huruf T ,buatlah

goresan pada daerah 1/2 lingkaran secara zig-zag.

5.Pijarkan ose dan dinginkan

6.Putar cawan 900 ,panaskan tepinya,kemudian buka kembali, buatlah goresan dengan
menyentuhkan ose pada goresan zig-zag yang telah dibuat di daerah I sebanyak 3-4

kali lanjutkan ke daerah II.

7.Pijarkan dan dinginkan ose

8.Putar kembali cawan 900 ,panaskan bagian tepi,buka kembali dan buatlah goresan

zig-zag 3-4 kali dari daerah II ke daerah III.

9.Putar kembali cawan petri dengan menyentuhkan tepi cawan pada api

bunsen,letakkan kembali ke meja kerja.

10.Pijarkan ose , dinginkan dan letakkan kembali posisi semula.

B. Goresan Kwadran

Teknik goresan kuadran mirip dengan Goresan T , perbedaannya adalah pada

pembagian zona ,media lempeng dibagi menjadi 4 bagian.

C.Goresan sinambung

1. Siapkan media lempeng steril

2.Pada dasar cawan dibagi menjadi 2 bagian dengan menggaris tengah tengah cawan

menggunakan spidol.

3. Pijarkan ose berkolong , dinginkan kemudian ambillah sampel sebanyak 1 mata ose.

4.Ambilah media lempeng yang telah dibagi menjadi 2 zona, putarlah bagian tepi

sambil disentuhkan api bunsen, cawan dibuka kemudian dari tengah cawan dibuat

goresan 1/2 permukaan cawan.

5.Putar cawan 1800

6. Dengan sisi yang sama (ose jangan dibalik) ,Goreskan kembali ose (tanpa dipijarkan)

, ke daerah II, dari tengah kuadran ke arah bawah.

7. pijarkan kembali ose ,dinginkan dan letakkan kembali di tempat semula.

D.Goresan radian

1. Siapkan media lempeng Steril

2.Tandai bawah media dengan membuat garis-garis bantu seperti pada gambar

3. Pijarkan ose berkolong dan dinginkan kembali

4.Ambil sampel dengan ose berkolong sebanyak 1 mata ose

5.Buatlah goresan terputus mulai dari tepi hingga seluruh area cawan tergores dengan

mengikuti garis bantu yang anda buat.

6.Pijarkan ose dan dinginkan

7.Putar petri disk 900

8.Buat goresan terputus mulai dari tepi sampai lebih kurang 3/4 area , 1/4 sisa area

buatlah goresan tanpa terputus seperti pada gambar.

9.Pijarkan ose dan kembalikan pada posisi semula.

MEMBUAT GORESAN

Memulai membuat goresan T , membagi area pada bagian bawah petri

Bentuk bentuk goresan :

4.Isolasi dengan pengucilan 1 sel (single cell isolation)

Isolasi ini dilakukan dengan alat yang bernama mikromanipulator,alat ini untuk
menyendirikan bakteri dari kelompoknya sehingga yang diambil hanya satu bakteri
saja. Cara bekerjanya yaitu : membuat beberapa tetes bergantung dengan mikropipet
pada kaca penutup yang diletakkan di bawah obyektif mikroskop, jika nampak tetesan
 bergantung tersebut hanya mengandung satu bakteri diambil dengan mikropipet
dipindahkan ke media cair untuk dikembang biakkan, setelah itu di kultur menjadi
biakan murni.

5. Inokulasi Pada hewan

Prinsip dari metode ini adalah Tidak semua bakteri dapat hidup di tubuh
hewan, jika kita mengambil dahak dari seseorang yang mengidap penyakit TBC,
kemudian dahak tersebut disuntikkan pada tikus putih maka tidak semua bakteri dapat
bertahan di tubuh tikus putih tersebut, yang dapat bertahan hanyalah kuman
penyebab TBC saja, sedangkan kuman lain yang hidupnya hanya diluar tubuh tidak
bisa bertahan hidup.

CATATAN :

Jangan rancu antara istilah inokulasi dengan Isolasi, inokulasi adalah memindahkan
mikrob secara aseptik, sedangkan Isolasi juga melakukan pemindahan ( inokulasi )
hanya saja tujuannya hingga mendapatkan mikroba yang hanya satu jenis ( kultur
murni ). Jadi Isolasi pasti melakukan inokulasi sedangkan inokulasi tidak selalu
melakukan isolasi. Literatur pada umumnya banyak menggunakan istilah Inokulasi,
untuk menggambarkan proses pemindahan mikroba secara aseptik , misalnya
memindahkan biakan murni dari media A ke Media B, Memindahkan mikroba jenis X
dari media yang berisi media campuran yang berisi miroba X, Y , Z , padahal kegiatan
ini sebenarnya merupakan kegiatan isolasi ( menyendirikan ) hingga mendapatkan
kultur mikroba yang hanya satu jenis ( kultur murni ). Alat dan metode yang digunakan
juga sama, oleh sebab itu istilah yang lebih banyak digunakan adalah INOKULASI.

PROSEDUR-PROSEDUR INOKULASI SECARA ASEPTIK

1. Mencegah aliran udara

2. Memulai bekerja dengan mencuci tangan

3.Teknik membuka sumbat

4.Membakar mulut tabung /cawanketika memulai dan mengakhiri transfer secara aseptik

5.Membakar ose, dinginkan sebelum mentrasfer bakteri ,bakar kembali

Membakar ose 450 dari dengan nyala api

6. Menstransfer bakteri dari cawan ke tabung reaksi

7. Memegang 2 tabung reaksi yang terbuka,selalu dekat api

8 .Pemindahan bakteri dari tabung reaksi ke tabung tabung reaksi,sumbat kapas tetap
 dipegang.

Inokulasi dari kultur campuran, membuat goresan pada media miring dan lempeng.

Hasil –hasil inokulasi

LAMPIRAN GAMBAR