A.

Tujuan Dapat melakukan inokulasi dan peremajaan biakan secara goresan maupun tusukan dengan baik pada media padat maupun cair dengan teknik kerja aseptis. B. Teori Dasar Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptik ke dalam media steril baik pada media padat maupun media cair. Inokula adalah bahan yang mengandung mikroba baik dalam keadaan cair maupun padat. Tujuan inokulasi adalah untuk memurnikan, mengidentifikasi, meremajakan, dan menyimpan mikroba. Biakan murni dilakukan untuk keperluan diagnostik, karakterisasi mikroorganisme, industri farmasi dan kegiatan lain yang berkaitan dengan mikroorganisme. Nutrisi dan lingkungan yang menunjang pertumbuhan mikroorganisme serta suatu teknik kerja aseptis yang dapat mencegah adanya kontaminan dalam biakan diperlukan untuk mendapatkan kultur yang murni. Untuk meningkatkan keberhasilan inokulasi mikroba diperlukan beberapa media yaitu media tumbuh,peralatan,dan metode inokulasi. Media Tumbuh Media ini merupakan media yang dipersiapkan untuk digunakan menumbuhkan mikroba. Komposisi media tumbuh disesuaikan dengan mikroba yang akan ditumbuhkan. Berdasarkan bentuknya, media tumbuh dapat dibagi menjadi cair (broth) dan media padat (agar). Perbedaan dari kedua media ini yaitu penambahan tepung adalah untuk memadatkan media. Sedangkan media padat dibagi menjadi tiga macam, yaitu media agar tegak (deep agar), agar miring (slants agar), dan lempeng agar (plate agar). Peralatan Peralatan utama yang diperlukan dalam melaksanakan inokulasi dan peremajaan biakan dalam media padat dan media cair ini adalah peralatan sterilisasi, inokulasi, dan inkubasi. Peralatan sterilisasi meliputi oven, alkohol, dan Bunsen. Macam-macam peralatan inokulasi adalah jarum ose, swab stick, blend glass, tabung reaksi, dan cawan petri. Peralatan inkubasi adalah inkubator. Metode Inokulasi Metode-metode yang dilakukan saat inokulasi adalah media cair dan media padat. Media Cair Pada media cair prinsip utama dalam menginokulasikan mikroba atau biakan adalah menumbuhkan mikroba tersebut dan mengamati pola pertumbuhannya. Media Padat Pada media padat prinsip utama dalam menginokulasikan mikroba atau biakan adalah menumbuhkan mikroba yang sudah ditentukan dalam praktikum dan mengamati karakteristik morfologisnya. Inokulasi pada media padat dilakukan dengan teknik agar miring, teknik agar tegak, dan teknik lempeng agar. Inokulasi mikroba dengan teknik lempeng agar dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu : Metode Gores (Streak plate) Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang di peroleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garisgaris goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan ini di lakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila di lakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan

sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni : a. Goresan seperti huruf T b. Goresan kuadran c. Goresan Radian d. Goresan Sinambung Metode Gores ini termasuk kedalam media plat agar dan media miring. Metode Tuang (Pour plate) Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran untuk penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung. Metode Tusuk Metode Tusuk ini yaitu dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media. Metode Tusuk ini termasuk kedalam media agar tegak dan media cair. Metode Sebar (Spread plate) Pada Metode Sebar ini dapat dilakukan dengan cara pemipetan (pipetting method), dan cara hapus (swab method). Sebelum diinokulasi, sumber mikroba diencerkan (dilution) terlebih dahulu agar populasinya tidak terlalu padat. Apabila tidak dilakukan pengenceran, maka populasi mikroba yang tumbuh pada media tumbuh menjadi terlalu padat sehingga akan sulit untuk mengidentifikasinya. Setelah diinokulasi, mikroba yang diinokulasi dengan benar akan tumbuh baik. Sumber mikroba yang masih padat dapat dilakukan inokulasi kembali, sehingga mikroba dapat diidentifikasi dengan tepat. Identifikasi dapat dilakukan secara langsung atau menggunakan buku panduan. Teknik aseptis sangat diperlukan pada saat memindahkan biakan dari satu tempat ke tempat lainnya. Penggunaan teknik aseptis mencegah terjadinya kontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat patogen. Teknik kerja aseptis, teknik dekontaminasi, serta penyelesaian pekerjaan secara cepat dan efisien perlu dipahami untuk menunjang pekerjaan yang berkaitan dengan mikroorganisme. Semua pekerjaan yang dilakukan pada praktikum inokulasi dan peremajaan biakan dalam media padat dan cair dilakukan berdasarkan prosedur teknik aseptis. Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Aturan prosedur secara umum pada teknik aseptis adalah mencuci tangan dahulu dengan sabun sebelum dan sesudah bekerja, gunakan masker dan sarung tangan, semprotkan alkohol pada sarung tangan, meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran, usap meja kerja dengan alkohol atau antiseptik , semua peralatan yang digunakan harus steril, atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan, menyalakan bunsen, membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat (flambir), telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Komposisi kandungan dari Nutrien Agar adalah ekstrak daging 10 gram, pepton 10 gram, NaCl 5 gram, aquades 1000 ml, dan 15 gram agar/L. Komposisi kandungan dari Nutrien Broth sama tetapi tidak ditambahkan agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades. Pada perpindahan bakteri pada media NA ataupun NB harus dilakukan flambir dulu alasan

dilakukan flambir itu yaitu agar pada media tersebut tidak terkontaminasi dengan bakteri lain. C. Alat dan Bahan Alat Cawan petri steril Tabung Reaksi steril Rak tabung reaksi Pipet agar 20 ml steril Pipet ukur 5 ml dan 10 ml steril Pinset Jarum ose bundar dan lurus Bunsen Papan pembentuk agar miring Inkubator 37 Bahan - Media nutrien agar cair bersuhu 50 - Media nutrient broth - Biakan bakteri : Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Escherichia coli D. Prosedur Kerja Pembuatan plat agar, agar miring, agar tegak, dan media cair dalam tabung : - Bunsen dinyalakan, nyala api diatur hingga berwarna biru. Dibiarkan menyala selama 10 menit. - Tabung reaksi steril disiapkan dan diletakkan pada rak tabung reaksi. - Cawan steril diletakkan diantara dua api Bunsen. A. Pembuatan plat agar - 20 ml media cair nutrien agar 50 dipipet. - Dimasukkan cawan petri steril. - Dibiarkan memadat. B. Pembuatan agar miring - 5 ml media cair nutrien agar 50 dipipet. - Tabung reaksi steril, diletakkan miring pada papan miring. - Dibiarkan memadat. C. Pembuatan agar tegak - 10 ml media cair nutrien agar 50 dipipet. - Tabung reaksi steril, diletakkan tegak pada rak tabung. - Dibiarkan memadat. D. Pembuatan media cair dalam tabung - 10 ml media nutrien broth bersuhu kamar dipipet - Tabung reaksi steril Teknik inokulasi pada plat agar, agar miring, agar tegak, dan media cair : a. Inokulasi plat agar - 4 area plat agar dibuat menggunakan spidol dipermukaan luar cawan petri bagian alas.

- Inokula dengan jarum ose bundar. - Bakteri diinokulasikan ke setiap bagian plat agar digoreskan rapat. b. Inokulasi agar miring - Inokula diambil dengan jarum ose bundar. - Bakteri diinokulasikan pada media, digores rapat secara zig-zag dari bawah sampai atas media agar miring. c. Inokulasi agar tegak - Inokula diambil dengan jarum ose lurus. - Bakteri diinokulasikan pada media, dengan cara jarum ose ditusuk tepat pada poros tengah tabung sampai mendekati dasar tabung. - Ditarik perlahan. d. Inokulasi media cair - Bakteri diinokulasi pada media cair dengan pipet Pasteur. - Bakteri yang diinokula dari agar miring diambil dengan jarum ose bundar. - Disuspensikan pada nutrien broth. Inokulasikan semua media yang sudah diinokulasi ke dalam inkubator 37 ; waktu 24 jam. E. Data Pengamatan Inokulasi pada Plat Agar : Jenis biakan bakteri Hasil inokulasi dengan goresan Bacillus subtilis Tidak ada bakteri. Staphylococcus aureus Posisi bakteri zig-zag tidak teratur, dan sangat banyak. Escherichia coli Posisi bakteri zig-zag di seluruh permukaan, dan sangat banyak. Pseudomonas aeruginosa Posisi bakteri di seluruh permukaan menjulur ke dalam, di pinggir tidak ada. Inokulasi pada Agar Miring : Jenis biakan bakteri Hasil ditambah nutrien Bacillus subtilis Posisi bakteri diatas permukaan dan agar berwarna kuning. Staphylococcus aureus Posisi bakteri diatas permukaan agar-agar membentuk zig-zag berwarna putih&agar berwarna putih kekuningan. Escherichia coli Posisi bakteri diatas permukaan agar-agar dan pada dinding tabung. Inokulasi pada Agar Tegak : Jenis biakan bakteri Hasil ditambah nutrien Bacillus subtilis Bakteri diatas permukaan, panjang melintang, dan warna agar kuning. Staphylococcus aureus Bakteri diatas permukaan, panjang melintang, dan warna agar kuning. Escherichia coli Bakteri di atas permukaan agar panjang melintang. Inokulasi pada Media Cair : Jenis biakan bakteri Hasil inokulasi Bacillus subtilis Posisi bakteri melayang menggumpal di atas permukaan, warna larutan bening.

Staphylococcus aureus Posisi bakteri tersebar (serabut putih), warna larutan bening. Escherichia coli Posisi bakteri di bawah permukaan (putih menggumpal), warna larutan putih keruh. Waktu inokulasi pada tanggal 19 Oktober 2010 10:00 AM. Waktu pengamatan hari Kamis, 21 Oktober 2010 10:05 AM. Warna media sebelum diinokulasi tidak ada perubahan, setelah diinokulasi masih tidak ada perubahan. Tetapi setelah diinkubator warna bakteri pada cawan petri dan tabung reaksi ada perubahan : - Pada media plat agar bakteri S.aureus terlihat jelas bentuk tumbuhnya zig-zag sesuai dengan awal mula dibiakan dengan metode gores zig-zag, dan medianya berwarna lebih tua dari sebelum diinkubator. Sedangkan di tabung reaksi pada media agar tegak, S.aureus dengan menggunakan metode tusuk terlihat bakteri tumbuh sesuai dengan posisi awal pada saat ditusuk, warna media pun menjadi kuning keruh. Pada media agar miring S.aureus tumbuh dengan pola zig-zag pula sesuai dengan metode gores zig-zag dan warna medianya tidak berubah tetap berwarna kuning. Dalam media cair S.aureus tumbuh di bawah tabung reaksi dan di permukaan tabung, warna medianya menjadi kuning bening. Maka S.aureus ini merupakan bakteri aerob fakultatif. - Pada media plat agar bakteri B.subtilis tidak terlihat adanya bakteri yang tumbuh pada media, warna media pun tidak berubah. Dalam media agar tegak bakteri B.subtilis yang dibiakan dengan menggunakan metode tusuk, tumbuh di atas permukaan tabung karena bakteri B.subtilis bersifat aerob. Sedangkan dalam agar miring B.subtilis bakteri terlihat tumbuh di permukaan miring tersebut, tetapi posisi tumbuh bakteri tidak sesuai dengan metode gores zig-zag yang dilakukan. Pada media cair B.subtilis tumbuh menggumpal diatas permukaan tabung, dan warna media berubah menjadi agak bening. - Pada media plat agar bakteri E.coli terlihat jelas bentuk tumbuhnya dengan menggunakan metode zig-zag yang sangat teratur sesuai dengan awal mula dibiakan dan warna media menjadi kuning bening. Dalam media agar tegak bakteri E.coli tumbuh baik dengan menggunakan metode tusuk,terlihat bakteri tumbuh sesuai dengan posisi awal pada saat ditusuk, warna media pun menjadi kuning keruh,sedangkan dengan media agar miring bakteri E.coli tumbuh tidak rapih ketika melakukan metode gores secara zig-zag, warna media menjadi putih keruh. Pada media cair bakteri E.coli tidak terlihat tumbuh, tetapi warna media berwarna putih keruh, sehingga bakteri E.coli bersifat aerob fakultatif. - Pada media plat agar bakteri P.aeruginosa terlihat kurang jelas, bentuk tumbuhnya zig-zag sesuai dengan awal mula dibiakan dengan metode gores zig-zag, dan medianya berwarna putih bening. F. Pembahasan Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu bacil (batang), coccus (bulat), dan spirilum atau spiral. Bakteri yang berbentuk batang maupun coccus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Coccus dibagi monococcus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya dibagi 2 yaitu, setengah melengkung dan tidak melengkung.Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram positif berwarna ungu dan bakteri negatif berwarna merah.

Tipe-tipe biakan bakteri yaitu : Staphylococcus aereus Pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil, koloninya tersusun berjajar seperti rantai memanjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang berbentuk coccus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel mencapai 1 m, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunannya tekanan darah. Bakteri ini bersifat aerob fakultatif. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernapasan atas dan kulit. Staphylococcus aereus juga menghasilkan katalase yaitu yang menkonversi H2O2 menjadi H2O dan O2, dan koagulase, enzim yang menyebabkan fibrin berkoagulasi dan menggumpal. Habitat bakteri ini pada manusia didaerah, kulit, hidung, mulut dan usus besar. Gambar mikroskopik dari bakteri Staphylococcus aereus : Bacillus subtilis Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang gram positif bersifat aerob. Bakteri ini tersusun atas peptidoglikan, yang merupakan polimer dari gula dan asam amino. Peptidoglikan yang yang ditemukan di bakteri dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor. Habitat endospora bakteri ini adalah tanah, mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik, contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polimer seperti protein, pati, dan pektin. Sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen, akan tetapi apabila terkontaminasi dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau. Gambar mikroskopik dari bakteri Bacillus subtilis : Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunyai flagella polar, berukuran sekitar 0,5-1,0 m. Bakteri ini tidak menghasilkan spora dan tidak dapat menfermentasikan karbohidrat. Pada uji biokimia, bakteri ini menghasilkan hasil negatif pada uji Merah Metil, dan Voges-Proskauer. Bakteri ini secara luas dapat ditemukan di lingkungan alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. P. aeruginosa adalah patogen oportunistik. Bakteri ini merupakan penyebab utama infeksi pneumonia nosokomial. Meskipun begitu, bakteri ini dapat berkolonisasi pada manusia normal tanpa menyebabkan penyakit. Ketika bakteri ini ditumbuhkan pada media yang sesuai, bakteri ini akan menghasilkan pigmen nonfluoresen berwarna kebiruan, piosianin. Beberapa strain Pseudomonas juga mampu menghasilkan pigmen fluoresen berwarna hijau, yaitu pioverdin. Pseudomonas aeruginosa memproduksi katalase, oksidase, dan amonia dari arginin. Bakteri ini dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Gambar mikroskopik dari bakteri Pseudomonas aeruginosa : Escherichia coli Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada manusia seperti diare, muntaber, dan

masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika, biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. Pada percobaan yang dilakukan tidak ada bakteri lain yang tercampur pada masing-masing media, karena percobaan dilakukan berdasarkan teknik aseptis agar mendapatkan hasil yang baik dan sesuai dengan yang diinginkan. Gambar mikroskopik dari bakteri Escherichia coli : Perbandingan bakteri dalam beberapa media diperoleh berdasarkan permukaan luas, volume media, dan metode inokulasi yang baik. Pada media plat agar hampir semua bakteri memiliki permukaan luas yang sama dan jumlah yang banyak, kecuali pada bakteri Basilus subtilis dan Escherichia coli. Karena pada B.subtilis tidak terlihat bakteri yang tumbuh dalam media, sedangkan pada E.coli permukaan luasnya hanya pada tengah cawan petri saja, hal ini dikarenakan melakukan metode inokulasinya tidak baik sehingga bakteri tidak merata. Dalam tabung reaksi pada media agar tegak dengan menggunakan metode tusuk, semua bakteri tumbuh banyak sesuai dengan pola metode tusuk kecuali bakteri B.subtilis. B.subtilis tumbuhnya tidak terlihat, tetapi muncul sedikit bakteri diatas permukaan hal ini terjadi karena B.subtilis bersifat aerob, yaitu bakteri yang memerlukan oksigen untuk tumbuh. Pada media agar miring dengan menggunkan metode gores secara zig-zag semua bakteri tumbuh sesuai dengan pola metode gores secara zig-zag kecuali B.subtilis. Hal ini terjadi karena pada saat menggoreskan bakteri pada media, metode inokulasi yang dilakukan tidak baik sehingga hasil yang didapat tidak sesuai. G. Kesimpulan Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptik ke dalam media steril baik pada media padat maupun media cair. Sedangkan inokula merupakan bahan yang mengandung mikroba baik dalam keadaan cair maupun padat. Tujuan inokulasi yaitu, untuk memurnikan, mengidentifikasi, meremajakan, dan menyimpan mikroba. Media yang digunakan dalam inokulasi adalah media plat agar, media agar miring, media agar tegak, dan media cair dalam tabung. Metode-metode inokulasi mikroba yang digunakan yaitu, metode gores, metode tusuk, dan metode sebar. Berdasarkan kebutuhan oksigen pada bakteri dibagi menjadi aerob, anaerob aerob fakultatif, dan mikroaerofilik. Sedangkan berdasarkan bentuknya bakteri ada tiga macam yaitu, bacil (batang), coccus (bulat), dan spiral. Bakteri-bakteri yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, dan Escherichia coli. H. Daftar Pustaka Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta. Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta. Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta. Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga. Donacki, Nanci. 2004. Aseptic techniques used by Cell Culture specialists in handling products from and/or mammalian cells. http://protocol-online.org. James, Daniel E., 2008. Nine Safe Practices for the Microbiology Laboratory Carolina Biological Supply, Burlington, NC.John C. Schof ield, B.V.Sc., M.R.C.V.S. Essode-entials for Animal Research:A Primer for Research Personnel : Principles of Aseptic Technique. http://www.unmc.edu/Education.

Suhardi, S.H., Koesnandar, D. K. Indriani, H. Arnaldo. 2008. Biosafety : Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT. Multazam Mitra Prima.