A.

Defenisi isolasi dan inokulasi

teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untukm e n u m b u h k a n

m i k r o b a d i l u a r d a r i l i n g k u n g a n a l a m i a h n y a . Pemisahan mikroorganisme
dari lingkungannya ini bertujuanuntuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak
bercampur lagi dengan bakteri lainya, dan ini disebut dengan biakan murni

Inokulasi merupakan kegiatan pemindahan mikroorganisme baik berupa bakteri

maupun jamur dari tempat atau sumber asalnya ke medium baru yang telah dibuat
dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis.[1] Dengan demikian akan
didapatkan biakan mikroorganisme murni yang dapat dimanfaatkan untuk pembelajaran
maupun untuk kepentingan lainnya seperti kepentingan industri, pertanian, dan
kesehatan.[2] Inokulasi yang baik ditentukan oleh tingkat sterilitas ruangan, alat, dan
tenaga pelaksana baik kebersihan maupun teknik inokulasinya

B. JENIS MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI

Berdasarkan bentuknyanya media dibedakan menjadi:

1. Media Cair
Media cair digunakan untuk pembenihan diperkaya sebelum disebarke media
padat, tidak cocok untuk isolasi mikroba dan tidak dapat dipakai untuk mempelajari
koloni kuman. Contoh media cair Nutrient broth (NB); Pepton dilution fluid (PDF);
Lactose Broth (LB); Mac Conkey Broth (MCB), dan lain-lain.

Pepton merupakan protein yang diperoleh dari peruraian enzim hidrolitik seperti
pepsin, tripsin, papain. Pepton mengandung Nitrogen dan bersifat sebagai larutan
penyangga, beberapa kuman dapat tumbuh dalam larutan pepton 4%
2. Media semi padat

Adalah media yang mengandung agar sebesar 0.5 %

3. Media padat

Media padat mengandung komposisi agar sebesar 15 %.Media padat digunakan

untuk mempelajari koloni kuman, untuk isolasi dan untuk memperoleh biakan murni.
Contoh media padat Nutrient Agar (NA); Potato Detrose Agar (PDA); Plate Count Agar
(PCA), dan lain-lain.

Berdasarkan tujuan penggunaannya media dibedakan menjadi :

a. Media isolasi
Media yang mengandung unsur esensial yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
mikroba.

b. Media diperkaya
Media diperkaya merupakan media yang mengandung bahan dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan zat-zat tertentu yang ditambahkan seperti serum,
kuning telur, dan lain-lain.

4. Media Selektif
Media selektif merupakan media cair yang ditambahkan zat tertentu untuk

menumbuhkan mikroorganisme tertentu dan diberikan penghambat untuk mikroba

yang tidak diinginkan.Contoh media yang ditambahkan ampisilin untuk menghambat
mikroba lainnya.
 C. KARAKTERISTIK KOLONI

 Besar kecilnya kolonià berupa titik atau melebar sampai menutup

permukaan medium
 Bentuk à
memanjang, tepi rata atau tidak atau timbul menjulang dari
permukaan medium.
 Halus kasarnya permukaanà Halus, kasar atau tidak rata.
 Wajah permukaan à mengkilat atau suram
 merata.
 Kenaikan permukaanà rata dengan medium
 Warna à
keputihan atau kekuning-kuningan,merah muda, coklat, hijau, unggu
atau biru.
 Kepekaanà lunak seperti lendir, seperti mentega, kering atau keras.

D. Defenisis biakan murni

Biakan murni merupakan tahapan awal di dalam pembuatan bibit jamur.

Pembuatan biakan murni diperlukan ketelitian, kebersihan, dan keterampilan.
Pertumbuhan miselium jamur biasanya menggunakan media agar dekstrosa
kentang (potato dextrose agar / PDA).

E. TEKNIK PEMBIAKAN MURNI

1. Spread plate method (cara tebar/sebar)

Teknik spread platemerupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi

kultur mikroba dengan cara dipulas atau disebar padapermukaan media agar padat.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba.
2. Streakplate method (cara gores)

Teknik isolasi koloni bakteri dengan cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan

suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan media agar padat.

3. Pour plate method (cara tabur)

Teknik ini dilakukan menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril.

4. Pembiakan lapangan

Teknik ini dilakukan dengan cara membasahi seluruh permukaan agar dengan
suspense kuman. Hal ini akan menyebabkan pertumbuhan kuman merata.
Biasanya digunakan untuk uji kepekaan antibiotika dan uji jenis kuman dengan
bakteriofaga

5. Pembiakan agar miring

Teknik inokulasi bakteri dengan caramenggoreskan pada permukaan agar miring

6. Pembiakan dengan tusukan
Teknik inokulasi bakteri dengan caramenusukkan ose pada permukaan agar
tegak.

7. Biakan cair
Teknik ini dilakukan dengan carakedalam wadah yang berisi media cair dicelupkan
kawat.

F. CARA MENILAI KOLONI

Perhitungan secara langsung

Perhitungan jumlah mikrobia secara langsung, dipakai untuk menentukan jumlah

mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup Berbagai cara perhitungan
mikroba secara langsung menggunakan (Dwidjoseputro, 2005) :

1. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikrospis

Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda,
suspensi bahan atau biakan mikroba yang telah diketahui volumenya diratakan
diatas gelas benda pada suatu luas tertentu. Setelah itu preparat dicat dan
dihitung jumlah rata-rata sel mikroba tiap bidang pemandangan mikroskopik.
Luas bidang pemandangan mikroskopik dihitung dengan mengukur garis
tengahnya.

        2. Menggunakan filter membrane (miliphore filter)

Suspensi bahan mula-mula disaring sejumlah volume tertentu kemudian disaring

dengan filter membrane yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan
menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat
dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring (Jutono dkk, 1980).
       3. Menggunakan counting chamber

Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan satu tetes suspense bahan

atau biakan mikroba pada alat tersebut ditutup dengan gelas penutup kemudian
diamati dengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya
mikroba. Perhitungan ini dapat menggunakan hemositometer. Peteroff Hauser
Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. 

G. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN KULTUR

Kultur murni umumnya ditanam pada media agar. Setelah inokulan (satu potong
kecil miselium) dimasukkan pada media maka kultur murni cukup dibiarkan pada suhu
ruang sampai tumbuh miselium baru. Tergantung macam medianya, miselium jamur
tiram akan tumbuh memenuhi media hanya dalam beberapa hari sampai dua minggu.
Kultur murni sebaiknya dibuat dengan beberapa tabung untuk keperluan stok yang
akan disimpan dan kultur sediaan yang akan digunakan untuk membuat bibit induk.
Kultur stok tidak boleh habis sehingga setiap membuat kultur, sebagian dijadikan kultur
stok.
Banyaknya kultur sediaan tergantung banyaknya bibit induk yang akan dibuat. Kultur
sediaan sebaiknya diperbanyak dalam cawan petri karena mempunyai luas permukaan
yang lebar. Miselium jamur tumbuh di permukaan media agar. Oleh karena cawan petri
permukaannya lebih lebar (diameter 9 cm) dari satu ose miselium maka massa
miselium yang tumbuh di permukaan media dalam cawan petri lebih banyak
dibandingkan dengan menggunakan tabung reaksi. Miselium akan lebih mudah diambil
sebagai inokulan apabila ditanam dalam cawan petri. Kultur dalam cawan petri tidak
bertahan lama karena lapisan media yang tipis mudah kering. Sebaiknya kultur tersebut
langsung digunakan semua sebagai inokulan untuk membuat bibit induk.
Kultur stok disimpan dalam bentuk kultur agar miring untuk cadangan sewaktu-
waktu kultur sediaan terkena kontaminasi atau gagal saat membuat bibit induk. Kultur
stok bisa juga disimpan dalam bentuk kultur cair atau kultur liofilik. Kultur liofilik apabila
akan digunakan harus ditumbuhkan terlebih dahulu pada media agar menjadi miselium
baru. Kelebihan kultur liofilik dapat disimpan untuk waktu yang sangat lama (sampai
bertahun-tahun) apabila disimpan dalam refrigerator. Kultur agar miring atau kultur cair
yang disimpan dalam refrigerator akan tahan disimpan selama 6-12 bulan. Kultur agar
miring yang disimpan dalam suhu ruang hanya bertahan kurang lebih 1-2 bulan
tergantung tinggi rendahnya suhu ruang.
“Agar daya simpan lebih lama, kultur agar miring atau kultur cair yang disimpan
dalam refrigerator harus ditutup dengan sangat rapat untuk menghindari pengeringan.
Penutup kapas pada tabung dilapisi lagi menggunakan plastik film atau dilapisi dengan
lilin, lalu dikemas dalam kantong plastik. Setiap tabung kultur diberi label yang berisi
kode, nama spesies, dan tanggal mulai penyimpanan. Tanggal mulai penyimpanan
untuk menandai kultur yang telah kedaluwarsa. Kultur dalam media agar yang terlalu
lama disimpan menyebabkan media menjadi kering sehingga miselium jamur juga
kering dan mati.”

Dalam mengulturkan biakan murni untuk pemeliharaan, sebelum masa simpan

habis, kultur murni bisa disubkulturkan kembali. Setelah miselium hasil subkultur
tumbuh merata, disimpan kembali dengan teknik yang sama di dalam refrigerator.
Untuk menandai hasil subkultur beri label seperti saat penyimpanan pertama, tetapi
diberi tambahan kode subkultur. Namun, subkultur tidak bisa dilakukan berulang-ulang
pada media sintetik karena akan mengakibatkan penurunan sifat dan viabilitas (daya
tumbuh) pada media lignoselulosa. Cara subkultur pada media agar miring sebagai
berikut.
1. Ingat semua teknik kerja aseptis, menggunakan alat, bahan, tempat yang steril,
dan tangan juga disterilkan.
2. Keluarkan tabung kultur dari refrigerator, lalu biarkan di dalam suhu ruangan
sampai suhu media kultur seperti suhu ruangan.
3. Siapkan media agar (MEA atau PDA).
4. Ambil satu ose miselium, lalu pindahkan dan letakkan di media agar miring yang
baru. Tutup tabung kembali secepatnya menggunakan kapas.
5. Inkubasikan pada suhu kamar selama 3-5 hari maka akan tumbuh miselium baru
hasil subkultur.
6. Hasil subkultur dikemas menggunakan kantong plastik untuk disimpan kembali di
dalam refrigerator sebagai kultur stok. (ss)

H. Alamat URL video biakan murni

https://youtu.be/SrBbQZrpp4g

https://youtu.be/PR1dFoyw3bs