LAPORAN PRAKTIKUM

4&5

TEKNIK ISOLASI DAN TRANSFER KULTUR

Oleh :

Nama : Ramadhanty Khoirunnisa Salim Ridwan

Nim : 1811401060

PRODI GIZI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ‘AISYIYAH YOGYAKARTA

TAHUN 2019
TUJUAN PRAKTIKUM :

1. Mahasiswa mampu melakukan teknik isolasi dan transfer kultur

ALAT BAHAN :

1. Alat:cawan petri,tabung reaksi,Bunsen,bumer,ose jarum,ose mata,driglasky,sprayer untuk

akohol,korek api,autoclave,incubator,Erlenmeyer,mikropipet
2. Bahan: biakan bakteri,spritus,kapas,media nutrient agar (NA),plastic,karet,Koran,
Aquadest,alumunium foil,tisu .

CARA KERJA :

1. Pembuatan media tegak, agar dan di dalam cawan petri

a. Menghitung dan menimbang media dalam Erlenmeyer

b. Melarutkan dengan aquadest sesuai volume yang ditentukan

c. Sterilisasi pada suhu 121˚C selama 15 menit pada autoklaf

d. Setelah selesai sterilisasi, keluarkan Erlenmeyer dari autoklaf, goyangkan erlenmeyer untuk
mencampur isinya (jangan digojog keras)

e. Bagilah media agar tersebut menjadi 3 yaitu :

1) Pembuatan agar tegak

a) Dilakukan secara aseptis, mulut tabung reaksi kosong dan mulut Erlenmeyer berisi media dilewatkan
Bunsen

b) Memasukkan 5 ml media yang masih panas ke dalam tabung reaksi yang telah steril

c) Sumbatlah tabung reaksi dengan kapas

d) Letakkan tabung reaksi dalam posisi tegak dan biarkan media hingga menjadi beku

2) Pembuatan agar miring

a) Dilakukan secara aseptis, mulut tabung reaksi kosong dan mulut Erlenmeyer berisi media dilewatkan
Bunsen
b) Memasukkan 5 ml media yang masih panas ke dalam tabung reaksi yang telah steril

c) Sumbatlah tabung reaksi dengan kapas

d) Letakkan tabung reaksi dalam posisi miring dan biarkan media hingga menjadi beku

3) Pembuatan agar di cawan petri

a) Dilakukan secara aseptis, bibir cawan petri dan Erlenmeyer berisi media dilewatkan pada bunsen

b) Membuka tutup cawan petri dengan tangan kiri

c) Menuangkan media ke dalam cawan petri sebanyak 2/3 bagian cawan petri

d) Tutuplah cawan petri dengan segera

2. Isolasi

a. Menyiapkan media yang steril dalam Erlenmeyer

b. Membagi menjadi 3 bagian sesuai dengan teknik penanaman mikroorganisme, yaitu:

1) Streak plate

a) Media yang telah steril dimasukkan ke dalam cawan petri secara aseptis

b) Menunggu media menjadi beku

c) Jika media telah memadat, siapkan kultur mikroba yang ada dalam tabung

d) Buka tabung berisi kultur mikrobadengan memanaskan mulutnya dekat Bunsen

e) Pijarkan ose jarum sampai membara dan tunggu dingin

f) Ambil sel mikroba dalam tabung. Bakar mulut tabung dan tutup kembali tabung dengan kapas

g) Sel mikroba yang sudah menempel pada ose, selanjutnya digoreskan pada permukaan media agar yang
ada di cawan petri, dimulai dari bagian pinggir cawan petri, secara kontinu ose digerakkan ke kiridan ke
kanan sampai seluasi ¼ luasan media

h) Pijarkan ose, tunggu dingin, sambil posisi cawan petri diputar sedikit ke arah kiri. Goreskan ose
dengan goresan awal mengenai bagian akhir goresan pertama. Buat arah menyilang dengan goresan
pertama. Begitu seterusnya hingga goresan keempat. Pijarkan ose setiap akan digunakan untuk menggores
i) Inkubasikan pada suhu 37˚C selama 24 – 48 jam 2) Pour plate a) Secara aseptis, mengambil 1 ml
kultur mikroba yang telah diencerkan pada 10-1 dan meletakkannya pada cawan petri b) Menuangkan
media yang agak dingin pada cawan petri yang telah diisi kultur mikroba c) Tutup segera bibir cawan
petri dan bakar dengan Bunsen d) Putar-putar cawan petri agar merata e) Inkubasikan pada suhu 37˚C
selama 24 – 48 jam

3) Spread plate

a) Media yang telah steril dimasukkan ke dalam cawan petri secara aseptis

b) Menunggu media menjadi beku

c) Jika media telah memadat, ambil 1 ml kultur mikroba yang telah diencerkan 10-1

d) Ratakan dengan menggunakan driglasky atau batang L. Setiap kali menggunakan driglasky, pijarkan
terlebih dahulu.

e) Tutup segera bibir cawan petri dan bakar dengan Bunsen f) Inkubasikan pada suhu 37˚C selama 24 –
48 jam

3. Transfer kultur dari tabung ke tabung

a. Basahi tangan dengan alcohol dan lakukan langkah-langkah selanjutnya, aseptis

b. Siapkan tabung reaksi berisi media dan kultur dan ose

c. Peganglah ose seperti memegang pensil d. Pijarkan ose di atas api spiritus sampai merah membara

e. Biarkan ose dingin sebentar sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah

f. Buka tutup kapas pada tabung reaksi tempat kultur yang akan dipindah dengan jari kelingking

g. Bakar mulut tabung dengan Bunsen kemudian masukkan ose dan ambil kultur yang ada di dalam
tabung dengan ose

h. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas, lalu diletakkan di rak

i. Ambil tabung baru, buka tutupnya dan bakar mulutnya di atas api, masukkan ore tempat kultur
menempel dan goreskan pada media yang baru

j. Bakar kembali mulut tabung, tutup dengan kapas dan letakkan kembali
k. Panaskan ose setelah selesai dipakai atau sebelum diletakkan kembali

l. Inkubasikan tabung reaksi yang sudah diinokulasikan pada incubator

4. Transfer kultur dari tabung reaksi ke cawan petri

a. Pijarkan ose di atas Bunsen sampai merah membara

b. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah

c. Bakar mulut tabung dengan Bunsen, kemudian masukkan ose dan ambil satu ose kultur yang tumbuh di
tabung

d. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup dengan kapas, lalu letakkan dalam rak

e. Buka cawan petri berisi media menggunakan tangan kiri

f. Gorekan ose pada media dan tutup kembali cawan petri

g. Inkubasikan cawan petri yang sudah diinokulasikan pada inkubator.

HASIL PENGAMATAN :

Pada teknik isolasi :

Pengenceran = jus mangga 1 ml ditambah aquadest 9 ml,lalu diambil menguunakan ose jarum lalu
digoreskan ke cawan petri yg sudah beriisi NA

- pengenceran terdapat 4 jamur pada media N

-pada ose jarum terdapat 291jamur pada media NA

Pada teknik isolasi aseptis :

- Tabung ke tabung 6 jamur

- Tabung ke cawan petri tak terhingga

- Media cair tidak terhingga

PEMBAHASAN

Media pertumbuhan mikroorganisme merupakan substrat untuk ditumbuhkan atau dikembangkannya

suatu mikroorganisme. Dengan mengunakan media pertumbuhan sebagai substrat mikroorganisme maka
aktivitas mikrobia dapat dipelajari dengan mudah. Pada media pertumbuhan dapat dilakukan dengan
isolasi mikroba dengan kultur murni, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba.

Media pertumbuhan adalah bahan yang terbuat dari campuran-campuran zat makanan yang
dibutuhkan mikroba untuk perkembangan dan kebutuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi
media berupa molekul-molekul kecil yang dibuat untuk menyusun komponen-komponen sel. Dengan
menggunakan media maka dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga dapat
memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan dari bakteri tersebut. Media
pertumbuhan pada mikroba umumnya buat dari air sebagai bahan dasar pelarut media agar atau gelatin
atau silica gel yang berfungsi untuk memadatkan media dan juga senyawa atau unsur yang diperlukan
oleh mikroba berupa C.O,H,P dan N (makro) dan Fe, Mg (mikro) serta vitamin dan bahan bahan
tambahan lainnya seperti phenol red yang berguna sebagai indikator untuk tingkat keasaman media.
Pembiakan mikroba dalan laboratorium memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan
pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme.

Media pertumbuhan mikroba dibedakan menjadi 3 yaitu berdasarkan sifat fisiknya, komposisi
medianya dan tujuan kegunaannya. Berdasarkan sifat fisiknya media pertumbuhan terdiri atas 3 jenis
yaitu:

 Medium Padat : medium yang komposisi agarnya 15%

 Medium setengah padat : medium yang komposisi agarnya 0.4%
 Medium cair : medium yang tidak mengandung agar contohnya nutrient broth
(NB) dan lactose broth (LC)

Berdasarkan komposisinya medium pertumbuhan mikroba dibagi dalam 3 kelompok yaitu:

 Medium sintesis : Medium yang komposisinya diketahui zat kimianya secara pasti dan
jelas.
 Medium semi sintetis : Medium yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti.
 Medium non sintesis : Media yang dibuat langsung dari bahan dasarnya.

Berdasarkan tujuan kegunaannya medium pertumbuhan dibagi menjadi 5 yaitu:

  Medium untuk isolasi : pada umumnya media yang mengandung semua unsur essensial untuk
pertumbuhan
 Medium slektif : medium yang selain mengandung nutrisi juga mengandung senyawa
tertentu yang berfungsi sebagai penghambat atau mengurangi pertumbuhan mikroba bukan
sasaran.
 Medium diperkaya : medium yang bahan dasarnya untuk pertumbuhan mikroba tetapi
ditambahkan komponen-komponen kopleks lainnya seperti serum dan kuning telur.
 Medium untuk peremajaan kultur
 Medium untuk karakterisasi bakteri

 Teknik Isolasi dan Kultivasi Kultur

Metode pemupukan mikroba pada media padat dapat dibedakan menjadi tiga metode, yaitu
metode tuang (pour plate), metode permukaan (spread plate), dan metode gores (streak plate) yang
masing-masing memiliki keunggulan dan kelemahan setiap metodenya.

A. Metode tuang (Pour Plate)

Memipet sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan pengencer yang sudah ditambah bahan uji kedalam
cawan petri. Kemudian kedalam cawan tersebut dimasukkan media agar cair yang telah didinginkan
sampai suhu 45-470C sebanyak 12-15 ml tiap cawan petri (proses pemipetan dengan penuangan media
tidak boleh lebih dari 30 menit). Selama penuangan medium tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar
untuk menghindari kontaminasi dengan lingkungan sekitar. Secara hati-hati melakukan gerakan
melingkar atau gerakan seperti angka delapan agar sel mikroorganisme menyebar. Setelah agar memadat,
cawan-cawan tersebut diinkubasi dengan cara membalikkan posisi cawan.

B. Metode Permukaan (Surface/Spread plate)

Media pertumbuhan (agar) steril dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku.
Setelah media membeku atau memadat sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml atau 1 ml larutan sampel
yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. Driglasky dicelupkan kedalam alkohol 95%
dan dipijarkan sehingga alkohol tersebut habis terbakar. Setelah dingin, driglasky digunakan untuk
meratakan sampel diatas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri diatas meja.
 C. Metode goresaan (Streak plate)

Metode ini adalah metode dalam menumbuhkan mikroba di dalam media agar cawan dengan cara
menggoreskan ujung jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini
mikroba yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum ose. Cara
ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan
pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Ada beberapa
teknik dalam metode goresan, yaitu :

1) Goresan sinambung Pada goresan sinambung, ujung jarum ose yang telah diinokulasi kultur
digoreskan pada permukaan secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Metode goresan
ini digunakan untuk peremajaan mikroba ke medium baru.
2) ) Goresan “T” Pada metode goresan T, media pada cawan petri dibagi menjadi 3 daerah, ujung
jarum ose digoreskan pada daerah 1 secara zig-zag. Kemudian panaskan jarum ose dan tunggu
dingin dan lanjutkan goresan pada daerah 2, kemudian cawan diputar untuk memperoleh goresan
yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3.
3) Goresan kuadran Metode ini hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang
berbeda yaitu dibagi menjadi empat. Daerah 1 merupakan daerah awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroba. Goresan kedua dipotongkan atau disilangkan dari goresan
pertama sehingga jumlahnya lebih sedikit, dan begitu seterusnya hingga daerah 4 yang akhirnya
terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Pada tahap ini sterilisasi sangat dibutuhkan untuk menginaktivasi seluruh bentuk kehidupan mikroba
yang berkaitan dengan kemampuan reproduksi mikroba. Desinfektan merupakan sterilisasi kimia yang
merupakan salah satu bahan yang mampu membunuh mikroba penyebab infeksi. Teknik asepti juga
sangat diperlukan untuk menghindari mikroorganisme terkontaminasi yang menyebabkan terhambatnya
pertumbuhan mikroba. Teknik ini digunakan sepanjang kegiatan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan
sekitar maupun praktikannya. Teknik ini dilakukan dengan cara menyediakan alat-alat kerja yang steril
dan bekerja didekatkan dengan api bunsen agar tidak ada kontaminasi yang ada di udara ikut. Pada saat
waktu inokulasi jarum yang digunakan untuk memindahkan sebelum dan sesudahnyaya harus dipijarkan
terlebih dahulu menggunakan api bunsen setelah itu inakulasi biakan bakteri disimpan dan diinkubasi
dalam lingkuungan yang sesuai untuk pertumbuhan.
  Transfer Kultur

Mikroorganisme dipindahkan dari satu media ke media lainnya dengan cara sub kultur. Teknik ini
merupakan suatu teknik dasar yang penting dan selalu digunakan dalam menyiapkan ataupun
mempertahankan stok kultur. Mikroorganisme selalu ada baik di udara, di laboratorium, dan di peralatan.
Mereka dapat berperan sebagai sumber kontaminasi eksternal dan hal ini dapat mempengaruhi hasil
eksperimen, kecuali jika menggunakan teknik yang benar dalam subkultur. Seterilisasi sangat dibutuhkan
untuk inaktivasi total seluruh bentuk kehidupan mikroba,yang berkaitan dengan kemampuan reproduksi
mikroba, desinfektan adalah seterilisasi kimia yang merupakan salah satu germisida berupa bahan yang
mampu membunuh mikroba penyebab infeksi.(kusnadi 2003).

Kesimpulan

Pada praktikum ini mahasiswa dapat melakukan teknik isolasi dan tranfer kuntur dengan hasil Streak : 4
jamur, Spreag : 291 jamur, Tabung ke tabung : 6 jamur, Tabung ke cawang petri : tak terhingga dan Pour
: tak terhingga
 DAFTAR PUSTAKA

Aditiwati, P dan Kusnadi. 2003. Kultur Campuran dan Faktor Lingkungan Mikroorganisme yang
Berperan dalam Fermentasi Tea – Cider. Departemen Biologi – FMIPA Institut Teknologi Bandung.
PROC. ITB Sains dan Tek. 35 A, No (2), 147 – 162

Oram, R.F.S., Paul J. Hummer, Jr. 2001. Biology living system. Glence Division Mc Millan Company.
Waterville.

Dwidjoseputro, D., 1992, Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama
 LEMBAR VALIDASI

NAMA : Ramadhanty Khoirunnisa Salim Ridwan.

NIM : 1811401060

MATA KULIAH : MIKROBOILOGI PANGAN

JUDUL PRAKTIKUM :TEKNIK ISOLASI DAN TRANSFER KULTUR

TANGGAL PRAKTIKUM :24 Oktober 2019

TANGGAL PENGUMPULAN : 07 November 2019

( praktikan ) ( instruktur )