Media dan

Teknik Isolasi

Oleh : Amanda Vidyana, S.Pd.

Media

• Media adalah campuran bermacam-macam

zat hara untuk tumbuhnya mikroorganisme.
• Kebutuhan dasar mikroorganisme antara
lain air, karbon, energi, mineral dan faktor
tumbuh.
• Faktor tumbuh meliputi suhu, cahaya,
kelembaban, pH, pengaruh O2 di udara,
tekanan osmotik, pengaruh M.O sekitarnya
dan zat kimia.
Syarat Media Yang Baik Untuk Pertumbuhan M.O

 Media harus mengandung semua unsur hara yang

diperlukan untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan mikroba.
 Media harus memiliki tekanan osmosa, tegangan
permukaan dan pH yang sesuai kebutuhan
mikroba.
 Media harus steril, artinya tidak ada mikroba
selain mikroba yang akan di inokulasi.
 Bahan Dasar Pembuatan Media
• Air (H2O) sebagai pelarut
• Bahan pemadat, yaitu :
Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat
media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada
umumnya dan mencair pada suhu 45 oC.
Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar.
Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari
kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis
mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat.
Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus
digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme
autotrof obligat.
Bahan pemadat atau pengental yang umum digunakan
adalah Agar. Hal ini dikarenakan agar memiliki beberapa
kelebihan dibandingkan gelatin, yaitu:
1. Tidak berwarna, sehingga memudahkan pengamatan.
2. Dapat berubah dari fase sol ke gel dan sebaliknya dari
gel ke sol.
3. Komposisinya netral
4. Pada temperatur pembiakan tidak berubah bentuk.
 Macam-macam Media
Berdasarkan fungsi dan tujuannya, media dibagi menjadi:
a. Media Umum
Digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan satu atau lebih kelompok
mikroba secara umum. Contohnya: NA (Nurient Agar)

b. Media Pengayaan
Digunakan dengan tujuan memberikan kesempatan suatu jenis/kelompok
mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari mikroba lain yang
sama-sama berada dalam suatu media. Contohnya: Kaldu Selenit dan Kaldu
Tertationat.

c. Media Selektif
Merupakan media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis
mikroba tertentu, tetapi akan menghambat atau mematikan jenis-jenis mikroba
lainnya. Contohnya: media SSA (Salmonela Shigella), VRBA dan EMBA,
MSA.
d. Media Diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya
berdasarkan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial.
Misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan
warna media di sekeliling koloni. EMBA dan VRBA mampu membedakan
bakteri E.coli, Enterobacter dan Salmonella.

e. Media Diperkaya
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,
serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba
tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembangbiak, tetapi membutuhkan
komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar.
f. Media Perhitungan
Digunakan untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu
bahan. Media ini dapat berbentuk media umum, media selektif
maupun media diferensial.

g. Media Isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk
pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

h. Media Isolasi Khusus

diformulasikan untuk memenuhi kebutuhan terhadap M.O
spesifik, sehingga memungkinkan isolasi dan identifikasi lebih
cepat. Contohnya: agar Mannitol salt yang bersifat selektif
untuk Staphylococcus patogenik.
Berdasarkan sifat fisik atau kepadatannya, media dibagi
menjadi:

a. Media cair yaitu media yang tidak mengandung agar,

contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
b. Media setengah padat (semi padat) yaitu media yang
mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal,
tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan
tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke
seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna
jika tergoyang.
c. Media padat yaitu media yang mengandung agar 15%
sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Berdasarkan bentuknya, media dibagi menjadi:

a. Slant (agar miring) adalah tabung pembiakan yang

medianya disolidkan dalam keadaan miring.

b. Stab (agar diri) adalah tabung pembiakan yang medianya

disolidkan dalam keadaan tegak.

c. Deep Pour merupakan media yang biasanya mengandung 18-

20 ml media agar dan umumnya digunakan untuk membuat
pour plate untuk menghitung jumlah koloni bakteri.

d. Petri Plate merupakan media yang dilelehkan kemudian

dituangkan pada piring dan dibiarkan solid.
• Media Petri Plate dapat digunakan untuk
membiakkan bakteri dan memisahkannya
menjadi pembiakan murni melalui prosedur
Streak Plate.

• Media Deep Pour biasanya digunakan untuk

Pour Plate dimana media dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri
kemudian dihomogenkan dan dibiarkan
memadat.
Berdasarkan komposisinya, media dibagi menjadi:
a. Media Alami (organik) merupakan media yang
komposisinya disusun oleh bahan-bahan alami,
seperti kentang, daging, telur, ikan, umbi-
umbian.
b. Media Semi-Sintesis adalah media yang
tersusun atas campuran bahan alami dan bahan
sintesis. Misalnya: kaldu nutrisi.
c. Media Sintesis merupakan media yang tersusun
atas senyawa kimia. Misalnya: media
pertumbuhan dan perkembangan bakteri
Clostridium.
Tahap pembuatan media
1. Persiapan media
2. Perhitungan kebutuhan media berdasarkan
formula/resep
3. Penimbangan media sesuai perhitungan
4. Pelarutan media
5. Pengecekan pH media
6. Pengemasan
7. Sterilisasi media
8. Uji sterilitas media
 Teknik Isolasi
• Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis
bakteri dari biakan campuran menjadi biakan
murni.

• Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri

dari satu populasi jenis mikroba yang
semuanya berasal dari satu sel induk.
Preparasi Sampel
• Maserasi, yaitu teknik preparasi dengan
cara dihaluskan atau digerus
• Swab, yaitu teknik preparasi dengan cara
diusap
• Rinse, yaitu teknik preparasi dengan cara
dicelup atau dibilas
Preparasi Sampel dengan Teknik Pengenceran
(DILUSI)

• Tujuan dari pengenceran yaitu memperkecil atau

mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam
cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah
mikroba dalam sampel.

• Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan

pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
 Teknik Inokulasi
•Spread Plate (cawan sebar)
•Pour Plate (cawan tuang)
•Streak Plate (cawan gores)
Spread Plate (cawan sebar)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan
suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.

Prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :

• Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur
kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
• Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol
dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan
ditunggu beberapa detik.
• Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan
agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif
bila cawan ikut diputar.
• Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
SPREAD PLATE

A B
Pour Plate (cawan tuang)
• Teknik ini memerlukan agar yang belum padat
(>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri
ke dalam cawan petri lalu kemudian
dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
• Metode ini akan menyebarkan sel-sel bakteri
tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan
sel terendam agar (di dalam agar) sehingga
terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang
kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang
tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.
Prosedur cawan tuang/pour plate

• Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan

ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC)
• Teteskan 1 ml secara aseptis, lalu suspensi sel
kedalam cawan kosong
• Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian
putar cawan untuk menghomogenkan suspensi
bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
Pour Plate
Streak Plate (cawan gores)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari
campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium
baru
Cara kerja :
• Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores
secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.
• Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC
lanjutkan goresan sampai habis.
• Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk
mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk
peremajaan ke cawan atau medium baru.
Goresan Sinambung
Goresan T
Goresan Kuadran
Morfologi koloni bakteri

Pertumbuhan pada Cawan Petri

Hal-hal yang perlu diperhatikan:
1. Ukuran
- Small (kecil)
- Moderate (sedang)
- Large (besar)
2. Bentuk
o Circular
oIrregular
oSpindle
oFilamentous
oRhizoid
3. Elevasi
 Flat
Raised
Convex
Umbonate
4. Permukaankoloni
Halus mengkilap
Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
5. Tepian
Entire
Lobate
Undulate
Serrate
Felamentous
Curled
Morfologi koloni bakteri
Pertumbuhan pada Agar Miring/Slant
Morfologi koloni bakteri
Pertumbuhan pada Agar Tegak/Stab

Pertumbuhan pada Agar Diri

Bahan-bahan media
Trypticase Soy Agar (TSA)
• Trypticase 15 g
• Phytone 5 g
• NaCl 5 g
• Agar 15 g
• Aquadest 1000ml

Kaldu Nutrisi Agar (KNA)/ Nutrisi Agar (NA)

 Beef extract 3g
 Peptone 10 g
 NaCl 5g
 Agar 15 g
 Aquadest 1000ml
Tauge Agar
• Ekstrak tauge 1000 ml
(dari 100 g tauge)
• Sukrosa 60 g
• Agar 15 g
Pembuatan Nutrient Agar
1 2 3

4 5