MENGISOLASI KOLONI BAKTERI PADA MEDIA

ENDO AGAR, SALMONELLA –SHIGELLA AGAR DAN MAC CONKEY AGAR

Hari/ Tanggal : Selasa, 19 Maret 2019

Bahan : Biakan Feaces

Tujuan : Untuk mengetahui dan mengenali morfologi koloni

Metode : Streak Quadrant (Goresan quadrant)

Dasar teori :

Media merupakan suatu campuran bahan-bahan tertentu dengan aquadest yang dapat
menimbulkan mikro organisme pada derajat keasaman dan inkubasi tertentu, atau bahan yang
di gunakan untuk memperkembangakan mikro organisme di laboratorium secara invitro.
Sebelum di gunakan media harus dalam keadaan steril, artinya tidak di tumbuhi oleh mikroba
lain yang tidak di harapkan.
Persyaratan-persyaratan agar media dapat di tumbuhi dan mikroba dapat
berkembang dengan baik yaitu :
1) Dalam media harus terkandung semua unsur hara yang di perlukan untuk
pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri.
2) Media harus mempunyai tekanan osmosa dan PH yang sesuai dengan kebutuhan
mikroba.
3) Media harus keadaan steril.
Bentuk susunan dan sifat media di tentukan oeh senyawa penyusun media,
persentase campuran dn tujuan penggunaan. Bentuk media di tentukan oleh ada tidaknya
penambahan zat pemadat seperti agar-agar, gelatin, dsb. Bentuk media di kenal 3 jenis yaitu :
 medai pemadat
 media cair
 media semi sulid

Sesuai dengan fungsi fisiologid dari masing-masing komponen yang terdapat dalam
media, maka susunan media pada jenis memiliki kesamaan isi yaitu :
 Kandungan air
 Kandungan nitrogen
 Kandungan sumber air
  Faktor pertumbuhan

Berdasarkan susunan pembentukan, media di bedakan menjadi :

1) Media alami, yaitu mdia yang di susun oleh bahan-bahan alami, seperti : kentang,
tepung, daging,telur, dsb.
2) Media sintesis, yaitu media yang di susun oleh senyawa kimia, seperti : media untuk
pertumbuhan dan perkembangan bakteri Clostridium
3) Media semi sintesis, yaitumedia yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami
dan bahan-bahan sintesis
Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembngbiakan mikroba,
tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain misalnya sulasi, seleksi, evaluasi, dan diferensiasi biakan
yang di dapatkan. Berdasarkan sifat-sifatnya, media dapat di bedakan menjadi :
1) Media umum
2) Media pengaya
3) Media selektif
4) Media diferensial
5) Media penguji
6) Media perhitungan

Jenis-jenis Media :

1) Media Umum / Media Dasar

Merupakan media pembiakan sederhana yang mengandung zat-zat yang umum di

perlukan oleh sebagian besar mikroorganisme dan dipakai juga sebagai komponen dasar
untuk membuat media biakan lainnya. Secar rutin media ini selalu tersedia dilaboratorium,
contohnya : Nutrient Broth, Nutrient Agar, dll.
2) Enriched Media
Adalah perbenihan yang telah di tambahkan factor-factor pertumbuhan seperti darah,
vitamin, eksrak ragi, dsb sehingga bakteri yangsulit di tumbuhkan dapat di biak di perbenihan
ini. Media yang termasuk dalam Enriched Media yaitu Blood Agar dan Coklat Agar.
3) Media Selektif
Pada perbenihan ini, hanya bakteri tertentu yang bisa tumbuh dengan baik,
sedangakan bakteri lainnya dapat terhambat pertumbuhannya karena telah di tambahkan zat
atau bahan tertentu yang bersifat menghambat.
 Media yang termasuk dalam selektif media yaitu Taurocholate Citrate Broom
Thymul, Blue Suchrose Salt Agar (TCBS), Mac Conkey (MC), Salmonella Shigella Agar
(SSA), Endo Agar (EA).

1. MEDIA ENDO AGAR

Media Endo Agar adalah media media selektif dan media diferensial yang
digunakan untuk mengisolasi bakteri batang gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri
memfermentasi laktosa atau tidak. Media ini pada awalnya dibuat untuk mengisolasi bakteri
batang penyebab tifus (typhoid) kemudian berkembang menjadi media diferensial terutama
untuk konfirmasi pemeriksaan bakteri coliform.
Komposisi Media Endo Agar :

1. Jumlah Peptone 10 gram Lactose

2. 10 gram Di-potassium phosphate
3. 3,5 gram Sodium sulphite
4. 2,5 gram Agar
5. 10 gram Distilled Water Add to make 1 Liter pH akhir Media Endo : 7,5 ± 0,2 pada
suhu 25°C

Cara Pembuatan Media Endo Agar :

1) Timbang 36 gram bubuk Media Endo, larutkan dengan aquadest sebanyak 1 liter
2) Tambahkan 6ml basic fuchsin 10% dalam alkohol
3) Panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media
4) dalam autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit
5) Tunggu suhu sampai hangat-hangat kuku (45°C-50°C)
6) Homogenkan, tuang ke dalam cawan petri
 Interprestasi Hasil Media Endo Agar Pada bakteri yang tidak dapat memfermentasi
laktosa (contoh : Salmonella sp., Shigella sp.) koloni dan media akan berwarna transparan
atau tidak berwarna karena bakteri tidak memfermentasi laktosa. Pada bakteri yang dapat
memfermentasi laktosa (contoh : Escherichia coli, Klebsiella sp.) koloni dan media akan
berwarna merah atau merah muda, karena memfermentasi laktosa.

Reaksi : Na2SO4 + Basic Fuchsin → Leucofuchsin Laktosa (difermentasi bakteri) →

Formaldehide Leucofuchsin + Formaldehide → Na2SO4 + Fuchsin

2. MAC CONKEY AGAR (MCA)

Mac Conkey Agar (MCA) adalah suatu jenis media yang digunakan untuk
identifikasi mikroorganisme, yang merupakan medium kultur yang dirancang untuk
tumbuhnya bakteri gram negative dan noda mereka untuk fermentasi laktosa, serta
menghambat pertumbuhan mikroorganisme gram positif.
Mac Conkey Agar termasuk dalam media selektif diferensial bagi mikroba. Jenis
mikroba tertentu akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan
pada media ini. Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan
neutral red sebagai indicator warna. Media ini akan menghambat pertumbuhan bakteri gram
positif dengan adanya garam empedu yang akan membentuk kristal violet. Bakteri gram
negatf yang tumbuh dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa.
Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi
oleh endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam
yang akan bereaksi dengan garam empedu.
 Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen. Golongan
bakteri ini tidak memperlihatkan perubahan pada media. Hal ini menyebabkan warna
koloninya sama dengan warna media. Dimana warna koloni dapat dilihat pada bagian koloni
yang terpisah. Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada MCA, adalah sebagai berikut :

Salmonella dan Shigella                   : serupa media

Escherichia coli                             : merah dikelilingi zona keruh
Enterobacter dan Klebsiella             : merah muda dan mukoid
Enterococcus dan Staphylococcus   : kecil dan tidak terang tembus

Untuk membuat Media Mac Conkey Agar, timbang bubuk MCA menggunakan

neraca analitik kemudian masukkan ke dalam Erlenmeyer. Tambahkan aquades, diaduk
hingga homogen dengan batang pengaduk. Panaskan sampai larut sempurna di atas kompor
listrik. Cek pH hingga menunjukkan pH 7,4±0,2. Tutup mulut Erlenmeyer dengan kapas
berlemak, aluminium foil, dan diikat dengan benang pulung. Sterilkan pada suhu 121ºC
selama 15 menit di dalam autoclave. Tuang media ke dalam plate di depan api
bunsen. Setelah memadat, media siap digunakan.
Dalam label kemasan bubuk media MCA merk OXOID tertera 53 gram bubuk
media dilarutkan dengan 1L aquades. Jika kita ingin menggunakan 150 ml
aquades maka berat bubuk MCA yang harus ditimbang dapat dihitung sebagai berikut :

Media MCA termasuk media sintetis, karena kandungan zat penyusun dan
takarannya diketahui  secara jelas dan pasti. Kandungan yang terdapat dalam media MCA
adalah:
 Peptone 20,0 gr :Sebagai sumber nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri
 Lactose 20,0 gr :Sebagai sumber energi dan sumber karbohidrat
 Bile salt 5,0 gr  :Sebagai penghambat tumbuhnya bakteri gram positif
 Sodium chloride 5,0 gr :Sebagai pengatur keseimbangan tekanan osmosis pada media
  Neutral Red 0,075 gr :Sebagai indicator untuk mengetahui terbentuk tidaknya asam
karena pemecahan karbohidrat
 Agar 12,0 gr :Sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroba

Komposisi :

-          Peptone Yeast extract  = 17 gram        -          Agar  = 13,5 gram
-          Protease Pepton           = 3 gram                       -          Netral Red = 0,03 gram
-          Lactosa                     = 10 gram                     -          Crystal Violet  = 0,001gram
-          Bile salt no 3               = 1,5 gram                    -          Aquadest = 1000ml
-          Sodium Cloride           = 5 gram                      -          PH  = + 7,4
Alat :
-      Erlen Meyer
-          Sendok tanduk                        - Gelas ukur
-          Tabung Reaksi            - Tabung Durham
-          Beaker Gelas                - Botol semprot

Prosedur Kerja :

1) Timbang bahan tersebut di atas, masukkan dalam beaker gelas 50 mL dan larutkan
dengan aquadest dan masukkan dalam Erlen meyer.
2) Homogenkan dengan cara di panaskan di dalam pemanas selama 15 menit,
kemudian mulut Erlenmeyer di sumbat dengan menggunakan kapas, yang dilapisi
kertas, kemudian sumbatan tersebut di tutup kembali dengan menggunakan kertas,
lalu di ikat.
3) Sterilkan media tersebut di dalam autoclave pada suhu 121 derajat celcius selama
15 menit
4) Dinginkan dengan tuangkan ke dalam petridish dan simpan dalam lemari es.

Media dalam MCA ini mempunyai keistimewaan memilih bakteri enteric gram
negative yang memfrementasekan laktosa, karena media ini mengandung laktosa, crystal
violet dan netral rerbile salt. Kemampuan Ecoli memfregmentasekan laktosa menyebabkan
penurunan PH, sehingga mempermudah absorbsi netral red untuk mengubah koloni menjadi
merah bata.
 Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain : Enterobacter, proteus,
salmonella, shigella, aerobacter, enterococcus.

3. SALMONELLA SHIGELLA AGAR

Salah satu contoh media selektif yaitu salmomella shigella agar yang digunakan
untuk mengisolasi kuman Salmonella sp dan Shigella sp dari sampel feses, urin, dan
makanan. Untuk khusus isolasi kuman shigella, media ini tidak disarankan karena beberapa
strain shigella akan terhambat. Media ini tersusun atas beberapa bahan, seperti campuran
ekstrak, vitamin, mineral, dan asam amino, campuran bile salt, sodium sitrat, dan brilliant
green, neutral red ,dan ferric citrate. (Ageha, 2011). Perbenihan ini mirip dengan Mc. Conkey
Agar, hanya penggunaannya lebih khusus lagi untuk basil gram negatif patogen enterik,
sehingga dipakai untuk isolasi dari spesimen tinja terutama,Salmonella dan Shigella yang
keduanya memperlihatkan pertumbuhan koloni yang tak berwarna. (Edi,2012).
Komposisi Media SSA :

 Lab-Lemco powder 5,0 gr, Sebagai sumber vitamin B 

 Peptone 5,0 gr, Sebagai sumber nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan
mikroba 
 Laktose 10,0 gr, Sebagai sumber energy dan sebagai bahan karbohidrat 
 Bile Salt 8,5 gr, Sebagai penghambat tumbuhnya bakteri gram positif 
 Sodium Citrate 10,0 gr, Sebagai sumber nutrisi lain bagi mikroorganisme 
 Sodium thiosulphate 8,5 gr, Sebagai sumber nutrisi bagi mikroorganisme 
 Ferric citrate 1,0 gr, Sebagai bahan buffer dan aseptor electron 
  Briliant green 0,00033 gr, Sebagai inhibitor atau penghambat tumbuhnya
mikroorganisme lain 
 Neutral red 0,025 gr, Sebagai indicator untuk mengetahui terbentuk tidaknya asam
karena pemecahan karbohidrat 
 Bacto Agar 13,5 gr, Sebagai bahan pemadat media. 
 Sebagai bahan penghambat utama adalah garam empedu dan brilian green yang
tidak hanya menghambat bakteri garam positif saja tetapi meneekan pertumbuhan
basil patogen nonenterik lainnya.

Cara Pembuatan SSA :

Untuk membuat media SSA ditimbang bubuk SSA menggunakan neraca analitik
kemudian masukkan ke dalam Erlenmeyer. Larutkan bubuk SSA dalam Erlenmeyer dengan
aquadest, diaduk hingga homogen. Larutan dipanaskan menggunkan kompor listrik sambil
diaduk hingga larut sempurna. Ukur pH larutan dengan menggunakan pH stick, pH SSA
adalah 7 ± 0,2. Media dituang ke dalam plate sebanyak 15- 20mL dengan disertai proses
fiksasi. Media diberi label nama dan tanggal pembuatan. Media siap digunakan.

Cara kerja :

1) Terlebih dahulu diusahakan agar semua alat yang ada di dalam hubungannya dengan
medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi. Semua
pekerjaan harus dilakukan dekat bunsen agar keadaan sekitar saat pengerjaan tetap
steril.
2) Kemudian bakar ujung ose hingga memijar lalu buka tutup tabung reaksi yang berisi
koloni berupa susu lalu ambil suspensi koloni bakteri dengan ujung ose (pastikan
ujung ose tidak dalam keadaan memijar )
3) Lalu goreskan kedalam petridish secara gores (usahakan tidak terlalu tekan agar
tidak merusak media dan jangan dekatkan ujung ose dengan api karena bakteri bisa
mati )
4) Kemudian tutup petridish secara terbalik dan dibungkus.Keunggulan meenggunakan
metode gores ( streak method ) dalam penanaman bakteri pada nutrien agar plate
adalah memudahkan untuk melihat berapa banyak bakteri yang tumbuh dari goresan
 pertama yang bakterinya tebal hingga goresan terakhir yang bakterinya semakin
menipis.
5) Langkah selanjutnya, inkubasi media pada suhu 37º selama 24 jam.

Hasil Pengamatan :

1. Pada Media Endo Agar

Ditemukan 2 koloni yang berbeda

KOLONI I KOLONI II

Bentuk : Bulat Bentuk : Bulat

Warna : Kilat Logam Warna : Tidak berwarna

Ukuran : Besar, cembung Ukuran : Besar, cembung

Konsistensi : Non mukoid Konsistensi : Non mukoid

Sifat : Peragi laktosa Sifat : non peragi laktosa

 2. Pada Media Media Mac Conkey Agar

Hanya ditemukan satu jenis koloni saja

KOLONI

Bentuk : Bulat

Warna : Merah muda

Ukuran : Besar, cembung

Konsistensi : Mukoid

Sifat : Peragi laktosa

 3. Salmonella- Shigella Agar

Ditemukan 2 jenis koloni

KOLONI I KOLONI II
Bentuk : Bulat Bentuk : Bulat

Warna : Hitam Warna : Tidak berwarna

Ukuran : Besar, cembung Ukuran :Kecil , halus

Konsistensi : Non mukoid Konsistensi : Mukoid

Sifat : Non peragi laktosa Sifat : Non peragi laktosa

Kesimpulan : Pada ketiga media tersebut yaitu endo agar, salmonella-shigella agar dan mac
conkey agar tumbuh koloni bakteri yang berbeda.

Medan, 26 Maret 2019

INSTRUKTUR LAB. PRAKTIKAN

(SELAMAT RIADI, S.SI, M.SI) (KELOMPOK 9A)