Topik 2

PEMBUATAN MEDIA

A. Tujuan
1. Menerapkan Cara Pembuatan Padat untuk Pengujian Mikrobiologi
2. Menerapkan Cara Pembuatan Media Cair untuk Pengujian Mikrobiologi
B. Dasar Teori
Media adalah campuran nutrien atau zat makanan yang dibutuhkan oleh
mikroorganisme untuk pertumbuhan. Media selain untuk menumbuhkan mikroba juga
dibutuhkan untuk inokulasi dan isolasi mikroba serta untuk uji fisiologi dan biokimia
mikroba.
Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba,
yaitu : sumber energi misalnya gula, sumber nitrogen, juha ion anorganik esesnsial
dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin. Sifat media pembenihan yang iedal yaitu
mampu memberikan pertumbuhan yang baik jika ditanami kuman, mendorong
pertumbuhan cepat, murah, mudah dibuat kembali, dan mampu memperlihatkan sifat
khas mikroba yang diinginkan. Berdasarkan bentuknya media dibedakan menjadi :
1. Media cair ; digunakan untuk pembenihan diperkaya sebelum disebar
kemedia padat, tidak cocok untuk isolaso mikroba. Contoh ; Nutrient broth
(NB), Pepton dilution fluid (PDF).
2. Media semi padat ; media yang mengandung agar sebesar 0,5 %
3. Media padat ; digubakan untuk mempelajari koloni kuman, untuk isolasi
atau untuk memproleh biakan murni. Contoh : Nutrient Agar (NA), Potato
Detrose Agar (PDA).
4. Media selektif ; merupakan media cair yang ditambahkan zat tertentu
untuk menumbuhkan mikororganisme tertentu dan diberikan penghambat
untuk mikroba yang tidak diinginkan. Contoh : media yang ditambahkan
ampisilin untuk menghambat mikroba lainnya.
C. Hasil Lab dan Analisis Data
1. Data Hasil Lab
Prosedur Kerja Hasil Pengamatan
1. Timbang media 1. Nutrien Agar
sesuai prosedur

1
 dikemasan.

2. Serbuk media 2. Pepton Dilution Agar

dimasukan secara
hati-hati kedalam
erlenmayer

3. Tambahkan 3. Mc Conkey Broth

aquadest dan aduk
sampai merata
dengan batang
pengaduk

4. Untuk media yang 4. Plate Count Agar

perlu dipanaskan,

2
 gunakan pemanas
sampai media
tercampur
homogen

5. Untuk media cair, 5. Muller Hitton Agar

masukan sejumlah
9 ml kedalam
tabung reaksi, PDF
sebanyak 10
tabung, dan MCB
sebanyak 30
tabung

6. Pembuatan media
agar miring NA,
sebelum di autoklaf
tuangkan media
NA untuk agar
miring sejumlah
lebih 5 ml kedalam
tabung reaksi. Sisa

3
 media NA biarkan
dalam erlenmayer
7. Tutup erlenmayer
dan tabung reaksi
yang berisi media
dengan kapas
penutup tabung
8. Sterilisasi dengan
autoklaf pada suhu
121 0 C, tekana 1
atm selama 15
menit
9. Untuk media NA
miring, keluarkan
media dari autoklaf
dan bekukan dalam
posisi mirinng
10. Untuk media NA
dan MHA,
tuangkan dalam
cawan petri steril
dan tunggu sampai
beku.

2. Analisis Data
Berdasrkan hasil praktikum diatas dapat dianalis media-media :
 Nutrien Agar, warnanya yaitu kuning dengan adanya bercak-bercak putih
ditengahnta tetapi tidak terlalu jelas
 Pepton Dilution Agar, warnanya kuning dengan jenis cairan dlam tabung
reaksi karena PDF termasuk media cair
 Mc Conkey Broth, berwarna kecoklatan dengan adanya bulatan hitam
didalamnya tetapi tidak jelas

4
  Plate Count Agar, merupakan media padat dengan munculnya bintik-bintik
putih ditengah-tengah dan medium tersebut berwarna putih keabuan
 Muller Hitton Agar, merupakan agar padat dengan adanya bulatan-bultan
ditengah medium tersebut
D. Pembahasan

Pada percobaan kali ini bertujuan untuk mengetahui cara pembuatan media padat dan
media cair pada berbagai macam jenis media untuk pertumbuhan. Berdasarkan hasil diatas
maka akan dibahas :

1. Nutrien Agar (NA)

Hasil yang didapatkan yaitu nutrien agar tampak bening agak keemasan seperti
terlihat pada gambar yang menunjukkan warna asli dari media tersebut dan tidak ada
keruhan atau gumpalan, membuktikan bahwa media telah steril dan tidak mengandung
mikroba.
Adapun hasil praktikum media pertumbuhan mikroba dengan dengan menggunakan
Nutrient Agar (NA) yaitu sangat baik karena dalam media Nutriet Agar (NA)
mengandung zat-zat nitrogen (0,3 ekstrak daging sapi dan 0,5 pepton) dalam jumlah
yang cukup untuk pertumbuhan mikroba.

Nutrien Agar (NA) merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam
prosedur bakteriologi seperti uji produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk
pertumbuhan sampel pada uji bakteri,dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur
murni. Media ini biasanya mengandung :

 0,5% Peptone
 0,3% ekstrak daging sapi / ekstrak ragi
 1,5% agar
 0,5% NaCl
2. Pepton Dilution Agar
Berdasarkan hasil pengamatan terlihat bahwa perbenihan PDF berwarna kuning
jernih dan tidak ada partikel yang keruh ataupun endapan, hal ini membuktikan bahwa
media telah steril dari mikroba. Peptone memasok kebutuhan nitrogen yang diperlukan
untuk pertumbuhan. Peptone larut dalam air dan memberikan solusi yang jelas
diperlukan untuk pengamatan pertumbuhan mikroba.

5
3. Mc Conkey Broth

Mc Conkey Agar adalah medium kultur yang dirancang untuk tumbuh bakteri gram
negatif dan noda mereka untuk fermentasi laktosa. MCB merupakan media perbenihan
selektif yang mengandung garam empedu. Mc Conkey Agar adalah media selektif,
mengandung zat penghambat berupa garam empedu dan neutral red. Media ini
digunakan untuk pembiakan bakteri dari famili Enterobakteriacea dan semua bakteri
Gram negatif yang dapat atau tidak memfermentasikan laktosa
Prinsip kerja : Garam empedu dan Kristal violet menghambat pertumbuhan bakteri
gram positif. Laktosa dan PH indicator merah netral digunakan untuk mendeteksi
penurunan laktosa (bakteri yang dapat memfermentasikan Laktosa atau tidak).
Kandungan : Pepton dari kasein, pepton dari daging, NaCl, campuran garam empedu,
merah netral, Kristal violet, agar-agar.
Dalam media ini Enterobacteriaceae dan bakteri gram negatif akan membedakan
mereka ke dalam fermentor laktosa dan non-laktosa fermentor. Kehadiran garam empedu
dan kristal ungu akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme gram positif. Media
Mc Conkey Agar membedakan bakteri yang memfermentasi laktosa, (berkoloni merah
muda) dengan yang nonfermentasi (tidak berwarna).
4. Plate Count Agar
Berdasarkan hasil praktikum dan bahan refrensi menunjukan bahwa PCA berwarna
putih keabuan, berbentuk granula Medium plate count agar (PCA) dapat berfungsi
sebagai medium untuk menumbuhkan mikrobia.
Berdasakan komposisinya, PCA termasuk ke dalam medium semisintetik, yaitu
medium yang komponen dan takarannya sebagian diketahui dan sebagian lagi tidak
diketahui secara pasti. Sebelum dipanaskan tidak larut sepenuhnya dalam air, tetapi
masih terlihat serbuk-serbuknya, berwarna kuning dan terlihat keruh. Setelah dipanaskan
serbuk media larut seluruhnya dalam air, berwarna kuning.
Plate Count Agar (PCA) merupakan sebuah media pertumbuhan mikroorganisme
yang umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri total (semua jenis bakteri) yang
terdapat pada setiap sampel. Plate Count Agar (PCA) merupakan media padat, yaitu
media yang mengandung agar sehingga setelah dingin media tersebut akan menjadi padat
Komposisi Plate Count Agar (PCA) dapat bervariasi, tetapi biasanya mengandung :
0,5% trypton, 0,25% ekstrak ragi, 0,1% glukosa, 1,5% agar-agar. Plate Count Agar
(PCA) mengandung glukosa dan ekstrak ragi yang digunakan untuk menumbuhkan

6
 semua jenis bakteri. Plate Count Agar (PCA) mengandung nutrisi yang disediakan oleh
trypton, vitamin dari ekstrak ragi, dan glukosa yang digunakan sebagai sumber energi
bagi mikroorganisme sehingga mendukung pertumbuhan dari bakteri. Plate Count Agar
(PCA) bukan merupakan media selektif karena media ini tidak hanya ditumbuhi oleh
satu jenis mikroorganisme tertentu.
5. Muller Hitton Agar
Media Mueller Hinton Agar adalah media terbaik untuk pemeriksaan sensibilitas tes
(dengan metode Kirby-Bauer) pada bakteri non-fastidious (baik aerob dan anaerob
fakultatif) karena :
 semua bakteri dapat tumbuh karena media ini bukan merupakan media selektif
dan media diferensial.
 Mengandung starch (tepung pati) yang berfungsi untuk menyerap racun yang
dikeluarkan bakteri, sehingga tidak mengganggu antibiotik.
 Rendah sulfonamide, trimethoprim, dan tetracycline inhibitors.
 Mendukung pertumbuhan bakteri non-fastidious yang patogen.
Uji sensitifitas dilakukan pada permukaan MHA (Mueller Hinton Agar). Mueller
Hinton Agar merupakan media diferensial yang digunakan untuk melakukan uji
sensitifitas terhadap beberapa antibiotik yang dilakukan dengan cara mengambil biakan
bakteri dari nutrient bruth (NB) dengan menggunakan lidi kapas steril. Lalu diusapkan
merata pada seluruh permukaan media MHA. Kemudian ditempelkankan beberapa disk
antibiotik di atas permukaan media MHA dengan jarak tertentu dan diinkubasikan ke
dalam incubator selama 24 jam pada suhu 370C. Antibiotik yang di gunakan pada uji
sensitifitas adalah streptomisin, tetrasiklin, vankomisin dan gentamisisn.

Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai berikut:

 Mencampur bahan – bahan, dilarutkan dalam air suling dan dipanaskan

dalam pemanas air supaya larutannya homogen
 Menyaring dengan kertas saring, kain, atau kapas. Untuk media agar atau
gelatin, penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.
 Menentukan dan mengatur pH.
 Memasukkan media ke dalam tempat tertentu. Sebelum disterilkan, media
dimasukkan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain yang bersih, kemudian
ditutup kapas atau kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah
sewaktu disterilkan.
 Sterilisasi umumnya dilakukan dengan udara panas dalam autoclave pada
suhu 121° C selama 15- 30 menit (Sutedjo, 1991).

7
 PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam
pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok
untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut.
Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium
masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium
yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994).

Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti medium
pertumbuhan mikroba ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada,
sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat
berkembang biak. Sterilisasi harus bisa membunuh jasad renikyang paling tahan panas
seperti spora bakteri (Fardiaz, 1992).

Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosa mikrobiologis, sterilisasi

sangat diutamakan baik alat-alat yang siap pakai maupun medianya. Suatu alat atau bahan
dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk
vegetatif maupun spora. Oleh karena itu, bagi seorang pemula di bidang mikrobiologi
sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman, hal ini
semua merupakan dasar-dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi.

Sterilisasi berarti proses pemusnahan bakteri dengan cara membunuh

mikroorganisme. Dalam kegiatan penelitian mikroba, digunakan alat dan medium yang
steril, maka sterilisasi ini adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari
segala macam kehidupan atau kontaminasi oleh mikroba.

Proses sterilisasi berbagai media perbenihan ini adalah dengan metode sterilisasi
fisik panas kering, yaitu menggunakan autoklaf karena dengan teknik ini tidak merusak
kandungan atau komposisi dalam media perbenihan sehingga nutrisi dalam media tidak
berkurang. Proses sterilisasi dengan autoklaf dapat membunuh mikroorganisme dengan
cara mendenaturasi atau mengkoagulasi protein pada enzim dan membran sel
mikroorganisme. Proses ini juga dapat membunuh endospora bakteri.

Media-media yang ingin disterilkan harus di bungkus terlebih dahulu dinding

permukaannya dengan kertas dan di tutup dengan kapas untuk mulut tabung reaksi, hal
ini dilakukan agar mencegah terbentuknya uap air pada dinding luar dan bagian dalam
media. Rongga-rongga dalam autoklaf sebaiknya tidak di isi terlalu penuh dengan
wadah-wadah media supaya uap dapat mengalir dengan baik

E. Kesimpulan

8
 Nutrien Agar, warnanya yaitu kuning dengan adanya bercak-bercak putih
ditengahnya tetapi tidak terlalu jelas
 Pepton Dilution Agar, warnanya kuning dengan jenis cairan dlam tabung reaksi
karena PDF termasuk media cair
 Mc Conkey Broth, berwarna kecoklatan dengan adanya bulatan hitam
didalamnya tetapi tidak jelas
 Plate Count Agar, merupakan media padat dengan munculnya bintik-bintik putih
ditengah-tengah dan medium tersebut berwarna putih keabuan
 Muller Hitton Agar, merupakan agar padat dengan adanya bulatan-bultan
ditengah medium tersebut

9
 DAFTAR PUSTAKA
https://www.scribd.com/doc/244396015/bahan-bakteriologi-ttg-media-docx
https://www.google.co.id/search?tbm=isch&q=media+pepton+fluid+agar+pada+pembua
tan+media&spell=1&sa=X&ved=0ahUKEwi68buzqZ_cAhXXR30KHVS-
CUEQBQg7KAA&biw=1313&bih=608&dpr=1#imgrc=0W8q874BwT2FoM:

https://www.academia.edu/6488693/LAPORAN_PRAKTIKUM_MIKRO_1

10
 Topik 3
PEMBIAKAN BAKTERI
A. Tujuan
1. Melakukan Pemindahan Biakan Bakteri Secara Aseptik
2. Melakukan Cara Pembiakan Bakteri Dengan Metode Gores pada Media Rata dan
Miring
B. Dasar Teori

Pada penanaman mikroba perlu diperhatikan kebutuhan nutrisi untuk mikroba

tersebut sehingga dapat tumbuh dengan baik. Isolasi bakteri adalah cara memisahkan
bakteri dari alam dan menanamnya dengan cara dipulas atau disebar pada permukaan
media padat. Teknik untuk menanam bakteri adalah sebagai berikut :

1. Spread plate method ( cara tebar/sebar )

2. Streakplate method ( cara gores )
3. Pour plate method ( cara tabur )
4. Pembiakan lapangan
5. Pembiakan agar miring
6. Pembiakan dengan tusukan
7. Biakan cair
C. Data Hasil Lab dan Analisis Data
1. Data Hasil Lab
No Prosedur Kerja Hasil Pengamatan
1. Teknik Gores ( Streak 1. Biakan bakteri Escherichia coli
Plate Method)
a. Siapkan biakan
bakteri yang
akan ditanam
kembali
b. Bakar kawat
ose, biarkan
dingin
c. Sentuhan ujng
kawat ose pada

11
 koloni bakteri
d. Goreskan 2. Biakan bakteri Bacillus subtilis
kawat ose pada
permukaan
lempeng
nutrient agar
secra continue
sampai
setengah
permukaan
agar, putar
cawan petri dan
oles kembali
pada
permukaan agar
yang kosong
e. Bakar kembali
kawat ose
f. Inkubasikan
2. Biakan pada Agar 3. Biakan bakteri Staphylococcus aureus
Miring
a. Siapkan media
agar miring
b. Siapkan biakan
bakteri yang
akan ditanam 4. Biakan bakteri Serattia marcecens
kembali
c. Sentuhan ujung
kawat ose pada
koloni bakteri
d. Goreskan
kawat ose pada
permukaan agar

12
 miring secara
zigzag
e. Bakar kembali
kawat ose
f. Inkubasikan

2. Analisis Data
Berdasarkan hasil pengamatan diatasa maka dapat dianalisis bahwa :
1. Escherichia coli, memiliki warna koloni kuning
2. Bacillus subtilis, memiliki pigmentasi koloni berwarna putih
3. Stapilococcus aureus, berwarna putih
4. Serratia marcescens, menunjukan koloni bakteri samar-samar merah
D. Pembahasan
1. Hasil pengamatan bakteri Escherichia coli, yaitu memiliki warna koloni
kuning, bentuk koloni (form) bulat bertepi (sirkuler), bentuk tepian luar
(margin) tepi rata (entire), ketinggian pertumbuhan koloni bakteri (elevasi)
mbonate yaitu Bentuk cembung, dibagian tengah lebih menonjol dengan
ukuran relative sedang.
2. Bacillus subtilis memiliki pigmentasi koloni berwarna putih yang
berbentuk koloni (form) tidak beraturan, bertepi (ireguler), bentuk tepian
luar (margin) bergelombang (undulate), ketinggian pertumbuhan koloni
bakteri (elevasi) ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium
(flat). Koloni bakteri jenis ini datar dan ukurannya relatif besar.
3. Bakteri Stapilococcus aureus pada pengamatan berwarna putih, bentuk
koloni (form) bulat, bertepi (sirkuler), bentuk tepian luar (margin) entire,
ketinggian pertumbuhan koloni bakteri (elevasi) raised yaitu ketinggian
nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan. Koloni bakteri
ukurannya relatif kecil. Staphylococcus aureus dapat memfermentasi
karbohidrat antara lain: gukosa, dekstrosa, manitol, sukrosa, dan laktosa
serta dapat menghasilkan asam tetapi tidak menghasilkan gas.

13
 Staphylococcus aureus juga menghasilkan enzim koagulase dan enzim
katalase yang bersifat hemolitik, mereduksi nitrat menjad nitrit.
Staphylococcus aureus relatif resistan terhadap pengeringan, panas
(bakteri ini tahan pada suhu 50°C selama 30 menit) dan NaCl 7 %-8 %.
Patogenitas pada pada infeksi bakteri Staphylococcus aureus disebabkan
karena kemampuan organisme tersebut menghasilkan enzim koagulase,
kemampuan untuk berbiak, dan menyebar luas dalam jaringan tubuh
melalui pembentukan banyak zat ekstraseluler.
4. Serratia marcescens adalah suatu jenis bakteri gram negatif dari
family enterobacteriaceae. Hasil pengamatan menunjukan terdapat koloni
bakteri samar-samar merah, menunjukan koloni Serratia marcescens. Ciri-
ciri koloni Serratia marcescens pada media Mac Conkey : Koloni kecil,
smooth, sedikit cembung, tidak berwarna atau berwarna merah muda.
Bakteri ini bersifat fakultatif dan mampu tumbuh baik pada kondisi aerob
dan anaerob di dalam media buatan. Pertumbuhan optimumnya terjadi
pada pH media 9 dan suhu lingkungan 20-37 0C .
Media yang digunakan untuk inokulasi bakteri Escherichia coli, Stapilococcus
aureus, dan Bacillus subtilis adalah media agar miring. Media ini digunakan untuk
menumbuhkan biakan murni pada permukaan media dengan bentuk koloni yang
beragam.
Hasil praktikum pada setiap bakteri menunjukkan bentuk berbeda pada setiap
koloni. Perbedaan bentuk koloni yang dihasilkan dapat dipengaruhi oleh faktor
intrinsik, ektrinsik, dan implisit. Faktor-faktor tersebut berpengaruh terhadap pola
pertumbuhan suatu mikroorganisme. Diindikasikan terjadi kontaminasi pada sampel
sehingga tumbuh jamur atau spora juga pada media pertumbuhan.
a. Faktor Intrinsik, seperti pH, aktivitas air, kemampuan mengoksidasai-reduksi
,kandungan nutrient, bahan antimikroba dan struktur bahan makanan. Setiap
pertumbuhan mikroorganisme membutuhkan media yang berisi nutrisi, seperti
air, energi, nitrogen dan vitamin sehingga dapat tumbuh sesuai dengan
morfologinya.
b. Faktor Ekstrinsik, seperti suhu penyimpanan, kelembaban, tekanan gas, dan
pengaruh ultraviolet. Mikroorganisme membutuhkan suhu tertentu untuk dapat
tumbuh dan tetap hidup, sehingga diperlukan suhu penyimpanan yang tepat dan
sesuai dengan sifatnya.

14
 c. Faktor Implisit, seperti sinergisme dan antagonisme. Ketika mikroorganisme
tumbuh pada media ia akan bersaing untuk memperoleh ruang dan nutrisi,
sehingga terjadi interaksi di antara mikroorganisme yang berbeda. Interaksi yang
terjadi dapat saling mendukung dan saling menghambat.

E. Kesimpulan dan Saran

Dari semua uji inokulasi ini, masing-masing bakteri memiliki morfologi dan ciri-
ciri yang berbeda. Morfologi koloni dapat dilihat dengan jelas jika sebagai kultur murni
dalam suatu medium. Morfologi koloni bakteri dapat dibedakan berdasarkan:

1. Ukuran

2. Pigmentasi

3. Form

4. Margin

5. elevasi.

Perbedaan bentuk koloni yang dihasilkan dapat dipengaruhi oleh faktor intrinsik,
ektrinsik, dan implisit.

Berdasarkan hasil pengamatan yang menunjukkan bahwa pemindahan bakteri

secara aseptik harus dilakukan dengan hati-hati agar bakteri yang akan diamati tidak
terkontaminan dengan bakteri dari luar sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium
adalah benar- benar biakan murni.

15
 Daftar Pustaka
http://www.academia.edu/9920307/LAPORAN_PRAKTIKUM_MIKROBIOLOGI_
Penanambiakan_Inokulasi
http://repository.ipb.ac.id/jspui/bitstream/123456789/51539/5/BAB%20II%20Metod
e_%20G11rhe.pdf

16