PEMBUATAN MEDIA

I. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.
2. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.
3. Mempelajari teknik pulasan bakteri untuk pengecetan/pewarnaan bakteri.
4. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam.

II. LANDASAN TEORI

Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (zat
makanan) yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba termaksud bakteri patogen.
Selain untuk menumbuhkan mikroba medium dapat digunakan pula untuk isolasi,
memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba
(Khaeruni dan Satrah, 2017).
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh mikroorganisme
untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi di dalam media
berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel.
Dengan media, pertumbuhan dapat dilakukan dengan isolasi mikroorganisme
menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan dasar adalah air (H2O) sebagai pelarut dari agar-agar (rumput laut) dimana
agar-agar tersebut berfungsi sebagai pemadat media (Suhardi, 2013).
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis
mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik
pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di
tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya
memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium
ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk, 1993).
Media mikroorganisme pada dasarnya digunakan untuk menumbuhkan,
mengisolasi, menguji sifat-sifat fisiologi, hingga sebagai alat dalam menghitung
jumlah mikroorganisme (Lay, 1994). Media berisi campuran bahan nutrisi atau

1
zat-zat makanan yang dibutuhkan mikroorganisme, dimana komposisi sifat fisik
dan kimiawinya dapat terkontrol maupun tidak. Untuk menghasilkan media yang
dapat menjadi tempat mikroorganisme tumbuh dengan baik, maka media harus
memenuhi beberapa syarat, yaitu:
1. Mengandung semua nutrisi yang mudah dicerna mikroorganisme.
2. Mempunyai pH, tekanan osmose, dan tegangan permukaan yang sesuai.
3. Steril.
Media yang baik mampu menyuplai makanan yang dibutuhkan oleh
mikroorganisme. Supaya makanan dapat menstimulir pertumbuhan
mikroorganisme, maka harus mengandung unsur-unsur kimia yang dibutuhkan
mikroba, diantaranya karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi
dan sejumlah kecil logam lainnya. Hal ini senada dengan pernyataan Jawetz dan
Melnick (1996), bahwa media harus mengandung semua kebutuhan untuk
pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi (contoh: gula), sumber nitrogen, juga
ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin. Kondisi fisik
media juga dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme didalamnya.
Umumnya mikroba dapat tumbuh baik dalam kondisi pH tertentu, yaitu
pada rentang 4,6 – 7,0. Selain pH, mikroba juga hanya hidup dalam kondisi
tekanan osmose yang sesuai. Apabila sel mikroba berada pada kondisi tekanan
osmose yang tidak sesuai, maka akan mengalami plasmolisis atau dapat juga
membengkak yang mengakibatkan rusaknya sel. Selain itu, media yang baik juga
harus ada dalam kondisi steril. Kondisi steril yang dimaksud adalah media tidak
mengandung kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, maupun
mengaburkan atau menurunkan kualitas pengamatan mikroba murni.
Secara garis besar berdasarkan wujudnya, media mikroorganisme dibagi
kedalam tiga jenis.
1. Pertama media padat (solid), yaitu media dengan komposisi agar atau zat
pemadat kurang lebih 15% agar sehingga media menjadi padat. Umumnya
media padat digunakan untuk membiakan koloni bakteri atau fungi.
2. Kedua adalah media semi padat atau semi cair (semi solid), merupakan media
yang dibuat dengan komposisi agar pada konsentrasi kurang dari 0,5%. Media

2
 jenis ini umumnya digunakan untuk budidaya bakteri microaerophilic atau
untuk penentuan motilitas bakteri.
3. Ketiga adalah media cair (liquid, broth) merupakan media yang mengandung
nutrisi tertentu namun tidak ditambahi bahan pemadat, seperti gelatin maupun
agar. Umumnya jenis media ini digunakan untuk pertumbuhan mikroalga.
Contoh medium cair antara lain nutrient broth (NB) dan glukosa broth.
Berdasarkan komposisi kimiawi komponen penyusunnya, maka media
terdiri atas media alami (non-sintetis), media semi sintetis dan media sintetis.
Berdasarkan sifat kegunaannya, media mikroorganisme dapat dikategorikan
meliputi media; umum, selektif, deferensial, dan pengaya. Beberapa contoh media
yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi antara lain; lactose
broth, EMBA (Eosin Methylene Blue Agar, Nutrient Agar, MRSA (deMann
ogosa Sharpe Agar), Trypticase Soy Broth (TSB), Plate Count Agar (PCA),
Potato Dextrose Agar.
Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media adalah sebagai
barikut :
1. Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat
(gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk
membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut.
Untuk melarutkannya harus dimasak dan dipanasi, pencairan dan pemadatan
berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar,
terutama pada pH yang asam.
2. Pepton, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.
Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
3. Beef extract, beef extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa,
plasenta dan daging sapi.
4. Yeast extract, yeast extractterbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex).

3
5. Karbohidrat. karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam
amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan
dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.
Menurut Pelczar (1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya
digolongkan menjadi 7 golongan, yaitu:
1. Medium umum, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan yang
bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum. Contoh: Nutrien
Agar (NA) untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri, Potato Dextose Agar
(PDA) untuk menstimulasi pertumbuhan fungi.
2. Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe pertumbuhan
mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia
tertentu. Contoh: medium tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.
3. Media diperkaya (enrichment media), merupakan media yang ditambahkan
bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang
diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang
jumlahnya sedikit dalam suatu campuran berbagai mikroba. Contoh:
Chocolatemedia dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.
4. Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang
akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan yang ada
dalam suatu spesimen. Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik, garam dan
bahan-bahan kimia lainnya.
5. Media differensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia
atau reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh
memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan
dengan jenis lainnya.
6. Medium penguji (Assay medium), merupakan medium dengan susunan ertentu
yang digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan bantuan
bakteri. Contoh: medium untuk menguji vitamin-vitamin, antibiotik, dan lain-
lain.
7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang digunakan
untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan. Contoh: medium untuk
menghitung jumlah bakteri E. Coli air sumur.

4
III. PROSEDUR KERJA
ALAT DAN BAHAN:
1. Medium Nutrien Agar (NA, Oxoid)
2. Medium Nutrien Broth (NB, Oxoid)
3. Aquadest.
4. Cawan petri.
5. Tabung reaksi.
6. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmayer, penangas/elemen penangas)

CARA KERJA
1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan.
(Catatan : Buatlah 50 ml media NA untuk setiap kelompok kecil praktikum
dan 50 ml media NB untuk satu golongan praktikum). Penimbangan media
dilakukan secara teliti dan cepat, kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-
hati ke dalam erlenmeyer.
2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk.
3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai
media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih).
4. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu
menggunakan pipet volume : 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10
ml ke dalam tabung reaksi untuk NA tegak, 15 ml untuk NA dalam cawan petri
untuk percobaan 4b (metode isolasi pour plate), sisanya untuk NA dalam
cawan petri untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba di alam). Tutup tabung
reaksi denganpenutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)
5. Sebelum diautoklaf,tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok
praktikum dalam 1 golongan. Masing- masing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup
tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu
rapat!)
6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan

autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm 121oC. Pelajari cara mengoperasikan

autoklaf dengan benar!
7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada

5
 rak tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan
biarkan memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan
memadat (untuk percobaan 6 : pengenalan mikroba di alam). Media NA 15 ml

dibiarkan sampai suhu 45-50oC (untuk percobaan 4b : metode isolasi pour

plate).
8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini
akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

IV. HASIL

PDA NA

Media didalam tabung reaksi yang sudah di autoklaf dan dalam proses pemiringan
tabung reaksi untuk mendapatkan media miring, dimiringkan lalu didiamkan
beberapa saat sampai dingin dan membekun lalu kemudian disimpan dalam lemari
pendingin untuk digunakan pada pratikum selanjutnya.

Media PDA setelah di autoklaf, warnanya berubah dari sebelum di autoklaf

berwarna kuning keruh menjadi coklat bening setelah di autoklaf.

6
Media NA setelah di autoklaf, warnanya sudah berubah dari sebelum di autoklaf
berwarna kuning keruh dan setelah di autoklaf berwarna kuning bening.

Perbandingan warna media NA dan media PDA sesudah di autoklaf, warna

keduanya sebelum di autoklaf warnanya sama kuning keruh lalu sesudah di
autoklaf warna keduanya berbeda media PDA menjadi lebih pekat menjadi
kecoklatan.

7
V. PEMBAHASAN
Untuk mengamati bakteri di laboratorium kita harus dapat menumbuhkan
dalam biakan murni untuk dapat melakukan hal ini haruslah dimengerti jenis-jenis
nutrien yang diisyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang
menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. (Pelczar, 1986)
Dalam pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari nutrien media
yangdibuat. Kebanyakan mikroorganisme membutuhkan air. bahan-bahan yang
terlarutdi dalam air yang digunakan mikroorganisme untuk membentuk badan sel
danmemperoleh energi yangberasal dari bahan makanan. Perbedaan antara
mediumNA dan medium PDA yaitu terdapat pada nutrien penyusunnya. Pada
mediumNA, nutrien utama penyusunnya yakni adalah sepotong kaldu sedangkan
mediumPDA nutrien utama penyusunnya terdapat pada kentang. Karena itu
nutrient inidinamakan Potato Dextrose Agar.
Nutrient Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat,
yangmerupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia.
NAdibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan
agarsebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena
sifatnyayang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa
galaktamsehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. Dalam hal ini
ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber
protein,nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat dibutuhkan oleh
mikroorganismeuntuk tumbuh dan berkembang. Medium Nutrient Agar (NA)
merupakan mediumyang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang
padat dimanamedium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai
medium untuk menumbuhkan bakteri
Medium PDA (Potato Dekstrosa Agar) berdasarkan susunannya
merupakanmedium organik semi alamiah atau semi sintetis sebab terdiri dari
bahan alamiah yang ditambah dengan senyawa kimia; berdasarkan konsistensinya
merupakanmedium padat karena mengandung agaryang memadatkan medium;
berdasarkankegunaannya merupakan medium untuk pertumbuhan jamur. Medium
PDA terdiridari kentang yang berfungsi sebagai sumber energi, nitrogen organik,
karbon danvitamin, dekstrosa sebagai sumber karbon, agar sebagai bahan pemadat

8
mediumdan aquadest sebagai pelarut untuk menghomogenkan medium dan
sumber O2.
Pada praktikum mikrobiologi kali ini kami melakukan percobaan
pembuatan media padatan yaitu NA (nutrient Agar) dan PDA (Potato Dextros
Agar). Kami menimbang media padatan NA sebanyak 14,0003 gr dalam 500ml
pelarut aquadest dan media PDA sebanyak 19,507 gr dalam 500ml pelarut
aquadest lalu kemudian dipanaskan sampai media menjadi bening tidak ada
pengontaminen dan partikel pengotor lainnya didalam media lalu taruh sebagian
media pada tabung reaksi, setelah dipanaskan media didalam erlenmayer dan
tabung reaksi di autoklaf selama 2 jam dengan suhu 121C dan tekanan 1 ATM
untuk mensterilkan media, setelah disterilkan lalu media didiamkan dengan suhu
kamar sampai mendingin dan mengeras, media yang berada didalam tabung reaksi
dimiringkan untuk membuat media miring, tahap akhir pembuatan media adalah
dengan memasukan media kedalam lemari pendingin untuk digunakan pada
praktikum selanjutnya. Dimasukan ke lemari pendingan sebagai untuk disimpan
juga untuk meminimalisir tercemarnya media murni dari mikroba udara di ruang
terbuka agar tetap terjaga kemurnian medianya.
Media yang telah dipanaskan juga diberi tutup kasa agar larutan media
tidak terkontaminasi lagi oleh mikroba dari udara, ketika dipanaskan proses
pemanasan pun butuh waktu yang panjang sampai mendapatkan warna yang
jernih dan tidak ada lagi pengotornya dan harus tetp dijaga agar media tidak
meluber didalam mikrowave.

VI. KESIMPULAN
Pada praktikum kali ini kami melakukan percobaan pembuatan media
padatan yang kami gunakan adalah Media NA dan Media PDA dengan teknik
pemanasan dan autoklaf lalu media disimpan dalam lemari pendingin untuk
digunakan dalam praktikum selanjutnya.
Seperti yang kita tahu, untuk memperkembangbiakan mikroorganisme
perlu media pertumbuhan sebagai rumah bagi para mikroorganisme tersebut. Dan
begitu banyak media yang dapat digunakan misalnya : NA, PDA, NB, dan lai lain
yang dapat memenuhi karakteristik mikroorganisme yang akan di biakan.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, and Melnick, (1996), Mikrobiologi Kedokteran, EGC, Jakarta

Lay, B., (1994), Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada,
Jakarta
Khaeruni, Andi dan Vit Neru Satrah. 2017. Penuntun Praktikum Mikrobiologi
Pangan. Universitas Halu Oleo. Kendari.Machmud, M. 2013.
Laporan Praktikum Migrobiologi Pertanian. UniversitasSebelas Maret.
Surakarta.Suardani, Dkk. 2014
Identifikasi E Colli 0157:H7 dari Feses Ayam dan Uji Profil Hemolisisinya Pada
MediaAgar Darah
Jurnal kedokteran hewan. Vol8. No. 1.Suhardi, S.H., Koesnandar,D. K. Indriani,
H. Arnaldo 2015.
Biosafety: PedomanKeselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah
Sakit PT. Multazam Mitra Prima

10