INOKULASI KUMAN PADA MEDIA GRAM NEGATIF (ENDO & MC)

DAN UJI BIOKIMIA

A. Penanaman Kuman Gram Negatif dengan Endo dan MC (Mac Conkey)

Praktikum dilaksanakan pada :
Hari/Tanggal : Rabu, 5 Oktober 2022
Waktu : 3 jam
a. Tujuan
Tujuan dari penanaman kuman pada media endo dan MC yaitu untuk mengetahui
pertumbuhan kuman pada media endo dan MC serta dijadikan sebagai uji biokimia
dan bahan pewaranaan preparat dari kuman gram negatif.
b. Alat dan bahan
a. Bunsen
b. Ose bulat
c. Ose tusuk
d. Inkubator
e. Korek api
f. Spidol hitam
g. Rak tabung reaksi
h. Media Endo
i. Media MC
j. Cairan limbah cucian beras
c. Prosedur kerja
a. Gambarkan bagian bawah cawan petri media endo dan MC sebanyak 4
sektor. Tujuan dilakukannya pembagian 4 sektor pada media endo dan MC
yaitu untuk mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang
lain, sehingga mempermudah proses isolasi.
b. Nyalakan bunsen dengan menggunakan korek api yang telah disiapkan.
c. Sterilkan ose bulat dengan cara dibakar dengan api hingga membara.
d. Setelah ose membara lalu dibiarkan sampai hangat sehingga ose tidak
terlalu panas yang menyebabkan koloni rusak.
e. Setelah ose sudah tidak terlalu panas, lalu celupkan ose bulat ke dalam
cairan limbah cucian beras.
 f. Goreskan ose di atas media endo dan MC secara zig-zag pada setiap sektor
secara berurutan. Pada saat proses penggoresan hanya menggunakan satu
kali celup. Sehingga satu celupan digunakan untuk keempat sektor. Pada
saat penggoresan tidak diperkenankan untuk membuka cawan petri terlalu
lebar, namun hanya sebatas ose bulat yang bisa masuk untuk proses
penggoresan. Hal ini dilakukan agar media endo dan MC tidak tercemar oleh
kuman udara. Setelah itu tutup rapat kembali cawan petri yang telah digores.
g. Setelah selesai menggores, yaitu melakukan sterilisasi ose kembali dengan
membakarnya hingga membara.
h. Simpan media endo dan MC yang telah digores ke dalam inkubator dengan
suhu 370C selama 18-24 jam.
d. Hasil pengamatan

Gambar . Hasil inokulasi kuman dengan cairan limbah cucian beras.

Hasil pengamatan scr makroskopis:

Endo MC
1 2 1 2
Bentuk Abstrak Abstrak Bulat Abstrak
Warna Pink Putih dan pink Merah metalik Merah
Ukuran 5 mm 3 mm 3mm
Konsistensi Lengket Lengket Lengket
Elevasi Cembung Cembung Cembung Cembung
Tepi Tidak rata Tidak rata Rata
Sifat Gram (-) Gram (-) Gram (-) Gram (-)

e. Pembahasan
a. Media Endo
Media endo agar adalah media selektif dan media diferensial yang
digunakan untuk mengisolasi bakteri batang Gram negatif berdasarkan
kemampuan bakteri memfermentasi laktosa atau tidak. Media ini pada awalnya
dibuat untuk mengisolasi bakteri batang penyebab tifus (typhoid), kemudian
berkembang menjadi media diferensial terutama untuk konfirmasi pemeriksaan
bakteri coliform (Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan Citrobacter
fruendii). Bakteri coliform adalah parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas
dari air minum. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan bahwa
tingkat sanitasi yang rendah.
Berikut adalah komposisi pembuatan media endo agar:
Peptone : 10 gram
Lactose : 10 gram
Di-potassium phosphate : 3,5 gram
Sodium sulphite : 2,5 gram
Agar : 10 gram
Distilled Water : Add to make 1 Liter
pH akhir pada media endo : 7,5 ± 0,2 pada suhu 25°C
Cara pembuatan media endo agar:
1) Timbang 36 gram bubuk media endo, larutkan dengan aquadest sebanyak 1
liter.
2) Tambahkan 6ml basic fuchsin 10% dalam alkohol.
3) Panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media.
4) Sterilkan dalam autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit.
5) Tunggu suhu sampai hangat-hangat kuku (45°C-50°C).
6) Homogenkan, tuang ke dalam cawan petri.
Hasil pengamatan media endo agar:
Pada bakteri yang tidak dapat memfermentasi laktosa (Salmonella sp.
dan Shigella sp.) koloni dan media akan berwarna transparan atau tidak
berwarna karena bakteri tidak memfermentasi laktosa. Kemudian pada bakteri
yang dapat memfermentasi laktosa (Escherichia coli dan Klebsiella sp.) koloni
dan media akan berwarna merah atau merah muda, karena memfermentasi
laktosa. Jika berwarna hijau metalik maka artinya positif Escherichia coli dengan
Gram negatif.

b. Media MC
Media MC agar adalah media selektif dan media diferensial yang
digunakan untuk mengisolasi bakteri batang gram negatif berdasarkan
kemampuan bakteri memfermentasi laktosa atau tidak. Media MacConkey Agar
digunakan terutama untuk famili Enterobacteriaceae dan genus Pseudomonas.
Media MC agar dikembangkan oleh seorang bacteriologist yang bernama Alfred
Theodore MacConkey.
Berikut adalah komposisi pembuatan media MC agar:
Peptone (Pancreatic digest of gelatin) : 17 gram
Proteose peptone (meat and casein) : 3 gram
Lactose monohydrate : 10 gram
Bile salts : 1,5 gram
Neutral red : 0,03 gram
Crystal Violet : 0,001 gram
Agar : 13,5 gram
Aquades : 1 Liter
pH akhir pada media MC : 7,1 ± 0,2 pada suhu 25°C
Fungsi bahan pada komposisi media MC agar:
 Pepton untuk menyediakan nitrogen, vitamin, mineral dan asam amino
esensial untuk pertumbuhan bakteri.
 Laktosa untuk menyediakan karbon dan energi serta untuk membedakan
bakteri yang bisa memfermentasi laktosa dengan bakteri yang tidak
memfermentasi laktosa.
 Bile salts (garam empedu) sebagai agen selektif yang berfungsi
menghambat pertumbuhan bakteri gram positif.
 Kristal Violet sebagai agen selektif yang berfungsi menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif.
 Natrium Klorida untuk menyediakan elektrolit dan keseimbangan osmotik.
 Neutral red sebagai indikator pH, akan berwarna merah jika pH di bawah
ini 6,8.
 Agar untuk memadatkan media.
 Pepton untuk menyediakan nitrogen, vitamin, mineral dan asam amino
esensial untuk pertumbuhan bakteri.
 Laktosa untuk menyediakan karbon dan energi serta untuk membedakan
bakteri yang bisa memfermentasi laktosa dengan bakteri yang tidak
memfermentasi laktosa.
Cara pembuatan media MC agar:
1) Timbang 50 gram bubuk media MC, larutkan dengan aquadest sebanyak 1
liter.
 2) Panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media.
3) Sterilkan dalam autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit.
4) Tunggu suhu sampai hangat-hangat kuku (45°C-50°C).
5) Homogenkan, tuang ke dalam cawan petri.
Hasil pengamatan media MC agar:
Pada bakteri yang dapat memfermentasi laktosa (Escherichia coli dan
Klebsiella sp.) koloni dan media akan berwarna merah atau merah muda, karena
adanya produksi asam dari hasil fermentasi laktosa, dengan adanya
indikator neutral red media akan berwarna merah atau merah muda. Pada
bakteri yang tidak dapat memfermentasi laktosa (Salmonella sp. dan Shigella
sp.) koloni dan media akan berwarna transparan atau tidak berwarna karena
bakteri tidak memfermentasi laktosa menjadi asam.

B. Uji Biokimia
Praktikum dilaksanakan pada :
Hari/Tanggal : Rabu, 6 Oktober 2022
Waktu : 3 jam
1. Tujuan
Tujuan dari uji biokimia adalah untuk menanam kuman pada media gula-gula
bakteri dengan media endo atau MC.
2. Alat dan bahan
a. Spesimen media MC atau endo
b. Bunsen
c. Ose tusuk
d. Ose bulat
e. Media:
Glukosa
Laktosa
TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Simon Citrate
Urea
3. Prosedur kerja
a. Sterilkan ose bulat.
b. Ambil spesimen MC atau endo.
c. Ambil 1 mata ose bulat kuman gram negatif lalu celupkan ke media Glukosa
dan Laktosa. Sterilkan ose kembali.
d. Sterilkan ose tusuk.
e. Ambil 1 mata ose tusuk kuman gram negatif lalu tusuk ke media Urea, Simon
Citrate, dan TSIA
f. Masukkan semua media ke dalam inkubator selama minimal 8 jam dengan
suhu 37 derajat celcius.
4. Hasil pengamatan (pada lampiran)
5. Pembahasan
Uji biokimia merupakan uji aktivitas enzim dari sel kuman dan digunakan untuk
mengetahui sifat bakteri terhadap berbagai macam zat. Setelah melalui tahap uji
biokimia, media glukosa yang ditambahkan indikator fenol berubah menjadi warna
dari merah menjadi kuning yang menandakan adanya asam dan terbentuk gas yang
terjebak dalam tabung durham. Media Laktosa yang semula merah berubah
menjadi kuning menandakan bahwa adanya kuman yang memfermentasi
karbohidrat sehingga membentuk asam.
Penamaan TSIA diambil dari komposisi di dalamnya. Media TSIA mengandung 3
jenis gula yaitu berupa glukosa, laktosa, dan sukrosa sehingga disebut triple sugar,
serta mengandung besi (iron) dari ferric citrate. Media TSIA yang semula merah
berubah menjadi kuning dan media terangkat ke atas menandakan adanya gas dari
fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa. Pada media Simon Citrate berisi indikator
BTB (Brom Tymol Blue). Simon Citrate yang semula hijau berubah menjadi biru
menandakan adanya kuman yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon serta
media berubah menjadi basa. Pada media urea berisi indikator phenol red. Tujuan
dari uji urease adalah untuk mengetahui kuman yang mempunyai enzim urease
dapat menguraikan urea serta dapat membentuk amoniak. Pada hasil uji urease
terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu, artinya kuman memecah
urea membentuk amoniak.
C. Pembuatan Sediaan Preparat Kuman Gram Negatif dan Pengamatan
Praktikum dilaksanakan pada :
Hari/Tanggal : Rabu, 7 Oktober 2022
Waktu : 3 jam
1. Tujuan
Pewarnaan Gram untuk mempermudah proses identifikasi kelompok kuman
gram negatif atau kelompok kuman gram positif.
2. Alat dan bahan
a. Spesimen petri media endo dan MC
b. Ose tusuk
c. Ose bulat
d. Kaca preparat
e. Bunsen
f. Pipet
g. NaCl 0,85%
h. Bak pengecatan
i. Gram A
j. Gram B
k. Gram C
l. Gram D
3. Prosedur kerja
a. Ambil kaca benda yang sudah disterilkan. Ambil spesimen dengan ose tusuk
yang sudah disterilkan (pengambilan dilakukan dengan mendekatkan pada api
bunsen). Letakkan spesimen di atas kaca benda.
b. Ambil NaCl dengan ose bulat yang sudah disterilkan. Letakkan tetesan NaCl
pada kaca benda yang sudah terdapat spesimen di atasnya. Langsung
campurkan dengan membuat apusan berbentuk elips ukuran 2x3 cm. tunggu
hingga kering.
c. Taruh kaca benda yang sudah kering diatas bak pengecatan.
d. Fiksasi kaca benda dengan cara membakar bagian bawah kaca benda secara
sekilas dengan api.
e. Pengecatan dilakukan secara merata dengan Gram A didiamkan selama 5
menit.
 f. Setelah 5 menit lalu tiriskan dan pastikan tidak ada cairan Gram A yang
menggenang di atas kaca benda. Lalu dilanjut dengan meneteskan Gram B
secara merata dan diamkan selama 1 menit.
g. Setelah 1 menit lalu buang genangan cairan Gram B yang di atas kaca benda
dan gantikan dengan cairan Gram C selama 1 menit.
h. Setelah cairan Gram C lalu ganti dengan cairan Gram D selama 40 detik.
i. Dibilas dengan air biasa, lalu tunggu kering untuk bisa diamati di bawah
mikroskop
4. Hasil pengamatan

Pada hasil pengamatan diketahui bahwa

tipe kuman termasuk dalam jenis
basil. Kuman basil adalah kuman yang
berbentuk batang.

5. Pembahasan
Saat proses pewaranaan menggunakan cairan Gram, terdapat perbedaan dari
setiap jenis Gram. Pada Gram A adalah kristal violet. Pada Gram B adalah Iodine
yang berfungsi untuk mempertajam warna dalam proses perwarnaan pertama. Pada
Gram C adalah Alkohol yang berfungsi menjadi penghilang dan peluntur warna.
Pada Gram D adalah Safranin yang berfungsi sebagai counterstain.
Jika kuman Gram negatif melalui tahap pewarnaan, maka hasilnya akan
berwarna merah. Kuman Gram negatif tidak tahan terhadap alkohol. Jenis kuman
Gram negatif diantaranya adalah Enterobacteriaceae, Salmonella sp., Shigella sp.,
Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, dll.
Pada morfologi mikroskopik tipe kuman terdapat 3 jenis yakni:
 a. Bentuk batang (basil)

Kuman gram negatif berbentuk batang adalah jenis

kuman yang memiliki struktur sel yang terdiri dari selaput
luar yang disebut selaput kapsul, selaput periplasmik,
dan selaput dinding sel. Selaput dinding sel ini terdiri
dari lapisan peptidoglikan yang tipis dan tidak dapat
menahan warna safranin ketika bakteri tersebut diberi zat warna gram. Contoh-contoh gram
negatif yang berbentuk batang yaitu Pseudomonas, Vibrio, Yercinia, dan Francisella.

b. Bentuk bulat (kokus)

Kuman kokus adalah bakteri yang memiliki bentuk bulat, oval atau berbentuk seperti
rantai. Kuman kokus ditemukan baik sebagai sel tunggal atau melekat pada suatu permukaan.
Sebagian besar kuman kokus bersifat anaerob. Beberapa jenis infeksi seperti bakteremia,
selulitis, pneumonia, gangren, peritonitis, abses, luka gigitan dan penyakit radang panggul
disebabkan oleh bakteri kokus. Kuman kokus dapat berupa kuman gram positif atau gram
negatif. Veillonella adalah kuman kokus gram negatif.

c. Spiral
Kuman gram negatif yang berbentuk spiral dapat ditemukan hidup bebas di air,
tanah, ataupun hidup secara parasit dalam tubuh inangnya. Kuman ini biasanya
bersifat kemoheterotrof (tidak mampu menghasilkan makanan sendiri sehingga
mereka memenuhi nutrisi dengan mencari karbon dan energi dari senyawa organik).
Contohnya adalah Treponema pallidum yang merupakan kuman penyebab penyakit
sifilis. Salah satu contoh kuman gram negatif yang berbentuk spiral dan memiliki
Leptospira interrogans.